Jorge Andrade, Nelson Tomás, Sara Lourenço

Imunologia (2002/03), Prof. Carlos Sinogas

 

Licenciatura em Bioquímica

Imunologia

 

HIV: PERSPECTIVA IMUNOLÓGICA

 

Jorge Andrade, nº.14778

Nelson Tomás, nº.14869

Sara Lourenço, nº.14750

Évora, 2003

Índice

O que é o HIV?

SIDA – a imunodeficiência

Impacto global do HIV/SIDA

Constituição genómica e estrutural do HIV

Ciclo de vida do HIV

HIV-1 e terapias anti-virais

Abordagem humoral sobre o HIV

Perspectivas de desenvolvimento de futuras vacinas

HIV: Efeitos sobre a resposta celular

A fuga do HIV aos linfócitos T citotóxicos

A morte celular  - O processo apoptótico

As Proteases cisteínicas

Activação e Regulação das Proteases

A família Bcl-2

As Mitocôndrias e o Processo Apoptótico

O receptor TNF-R1: uma perspectiva geral

O paradigma da via apoptótica induzida pelo receptor Fas

PARP-1: um perpetuador do processo apoptótico?

A inibição do sinal apoptótico, induzido pela ASK-1, pelas proteínas 14-3-3

Apoptose: Uma estratégia do HIV para escapar ao S.I.

Aumento da taxa de destruição dos linfócitos T: a acção do HIV

Proteínas virais: a indução do processo apoptótico

ACAD e AICD nos linfócitos T

Proteína Nef/HIV-1: “Um convite para a morte”

A proteína Nef bloqueia o processo apoptótico induzido pela replicação do HIV:

Bibliografia

 

O que é o HIV?

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o agente causador da SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida) sendo um vírus linfotrópico com afinidade preferencial para os linfócitos T CD4+ (responsáveis, em parte, pelo controlo do sistema imunológico).

De maneira análoga a outras viroses, o HIV é um parasita que se replica dentro das células hospedeiras (Weiss, R.A., 2001), sendo que o tipo mais comum do vírus é conhecido como HIV-1 existindo outro tipo, o chamado HIV-2 que é, geralmente, menos virulento, produzindo, no entanto os mesmo efeitos registados para o HIV-1.

Taxonomicamente, o HIV pertence à família dos retrovírus e ao género lentivírus (fig 1):

 

Fig. 1 – Imagens do vírus da imunodeficiência humana (Hersh, 2001)

 

Foi isolado pela primeira vez em 1983 pelos pesquisadores Robert Gallo, nos EUA, e Luc Montagnier, na França sendo que, em 1986, um comité internacional recomendou o termo HIV (vírus da imunodeficiência humana) para denominá-lo, reconhecendo-o como capaz de infectar seres humanos (Kuby, 1994).

O caso mais antigo da infecção pelo HIV registado foi observado num marinheiro em Manchester que morreu com uma patologia semelhante à da SIDA em 1959. No entanto, a autenticidade deste facto não está confirmada. Além disso, análises genéticas de sequências de amostras obtidas no período entre 1971 a 1976, de membros de uma família Norueguesa infectados antes de 1971, mostraram que as viroses foram adquiridas a partir de grupos estranhos ao local referido ou seja, uma estirpe de vírus existente, principalmente, na África Ocidental (Zhu et al, 1998).

Embora não se conheça a origem do vírus, sabe-se que existe semelhança com a família de retrovírus relacionada a primatas não-humanos (macacos verdes africanos), que vivem na África sub-Sahariana, chamada de vírus da imunodeficiência símia (SIV). Esta hipótese de introdução do SIV em humanos foi proposta por um antropologista que estudou a tribo Igjiwi oriunda do Zaire. Este observou que, em rituais religiosos, o homem sacrificava o animal, fazendo a ingestão do seu sangue. Assim, o vírus SIV pode ter sido transmitido ao homem, sofrido mutação e atacado a espécie humana. Por isso, supõe-se que o HIV tenha origem no continente africano (Kuby, 2003). Além disto, a transferência de espécies cruzadas de HIV-1 e HIV-2 de chimpanzés e “mangabeys” para humanos pode ter provocado uma alteração da virulência, isto porque se sabe que alguns hospedeiros símios não desenvolvem SIDA. Esta alteração de virulência pode ser melhor detectada pela resposta do hospedeiro à infecção do que pelas propriedades do vírus. Uma possível explicação para este facto, é a de que a infecção do HIV activa o sistema imunitário humano em sem benefício, promovendo um conjunto de células tolerantes ao progresso da infecção e à apoptose (morte programada das células). A eventual diminuição da quantidade de linfócitos T-CD4+ denuncia o poder que o vírus tem contra o sistema imunitário (é como que uma balança em que os pratos representam o poder do vírus e do sistema imunitário, pendendo esta para o lado do vírus). Se se conseguir compreender como o hospedeiro controla a infecção provocada pelo SIV em macacos, talvez se consiga encontrar meios que possibilitem o controlo do HIV em humanos (Weiss, R.A., 2001).

Alguns estudos demonstraram que existe uma elevada taxa de variabilidade genética do vírus, tendo-se identificado, até agora, pelo menos doze subtipos genéticos, designados de A a J, pertencentes ao grande grupo do HIV-1 (estirpe dominante na epidemia global). Para muitas das regiões do genoma do HIV-1, os sub-tipos B e D estão mais relacionados entre si do que com qualquer outro sub-tipo do mesmo grupo. Contudo, análises filogenéticas das regiões env mostraram uma associação não usual entre viroses do sub-tipo B e F (fig.2) (Zhu et al, 1998;  McCutchan, 2000):

 

Fig. 2– Relação filogenética dos vários sub-tipos e das formas recombinantes existentes (McCutchan, 2000)

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De um modo geral, para se reproduzir, o HIV penetra no linfócito T auxiliado por uma proteína denominada CD4 que se encontra a rodear a célula. Esta proteína abre a passagem para o HIV, permitindo que se replique, destruindo o linfócito e libertando os vírus formados de novo. Como muitas das células são destruídas, o sistema imunitário desequilibra-se e enfraquece, deixando o organismo sem condições de reconhecer os agentes invasores. Mesmo depois de 10-11 anos após a infecção e do aparecimento dos anticorpos neutralizantes, o HIV causa imunodeficiência, matando biliões de células T. Desta maneira, o HIV torna-se o primeiro vírus para o qual um teste de anticorpos positivo é interpretado como indicador de doença (Kuby, 2003).

Devido ao facto do desaparecimento do vírus na sua forma livre, no sangue, ser largamente independente do estado em que se encontra a doença, os níveis de RNA viral no plasma reflectem a velocidade de produção viral. De facto, estudos recentes sugerem que o tempo de ½ do vírus livre é extremamente pequeno, na ordem dos minutos ou horas. Tal não se verifica para as células infectadas (fig. 3) (Finzi et al, 1998):

 

Fig. 3  – Tempos de ½ vida para o vírus livre e para as células infectadas (Finzi et al, 1998)

 

A infecção primária do HIV é caracterizada por níveis extremamente elevados de vírus no plasma, sendo normais valores acima das 106 cópias de RNA/cm3. Consequentemente, assim que se desenvolve a resposta imunitária ao HIV-1, os níveis virais decrescem até um estado denominado de equilíbrio, sendo estes valores prosgnósticos da velocidade de progressão da doença (fig. 4).

 

Fig. 4 – Diagrama esquemático do decurso da infecção viral (Rowland-Jones, 2003)

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Em pacientes assimptóticos não tratados, os níveis de RNA viral no plasma são razoavelmente estáveis (dias a semanas). Isto reflecte um estado de equilíbrio no qual o a produção viral iguala o seu desaparecimento, tendo sido este equilíbrio formalizado por Perlenson e seus colegas na forma da seguinte equação:

 

 

P = cV

 

(1)

 

onde P representa a velocidade de produção viral, c a constante de decaimento viral e V o número de viriões no plasma.

Numa aproximação primária, a dinâmica que suporta este equilíbrio entre a produção viral e o respectivo decaimento pode ser representado da seguinte forma:

 

 

dV/dt = NdT* - cV

 

(2)

 

na qual NdT*, o termo da produção viral, é o produto do número de viriões produzidos por célula infectada (N), d é a velocidade de perda  de produtividade das células infectadas e T* é o número de células infectadas. No estado estacionário, dV/dt = 0 e NdT* = cV.

Os valores médios para c e d são 3 e 0,5 dias-1, respectivamente. Estas constantes são, normalmente, avaliadas em termos do tempo de ½ vida (t½ = ln2/c, ln2/ d). Para o vírus livre, t½ < 6 horas. Para as células infectadas produtivas, t½ » 1-2 dias (Perelson et al, 1996).

 

SIDA – a imunodeficiência

O sindroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) traduz-se numa desordem clínica que representa a fase final de uma série de mudanças imunossupressivas. Estas  resultam de um complexo conjunto de fenómenos aos quais o organismo é sujeito, resultantes da infecção pelo HIV.

Os primeiros casos de SIDA foram descritos inicialmente nos anos de 1981 nos EUA e de 1982 no Brasil.

Uma pessoa infectada pode sentir-se bem e demonstrar saúde até dez anos ou mais antes de surgirem os sintomas. Porém, quando a doença começa a manifestar-se, os primeiros sinais mais frequêntes são:

-         Suor intenso, frequentemente à noite

-         Febre diária que pode não ser muito alta

-         Sensação constante de cançaso, mesmo estando em repouso

-         Diarreia que não passa com medicamentos, podendo durar muito tempo

-         Ínguas nas axilas, pescoço e virilhas que podem permanecer durante muito tempo

Na verdade, existem grande número de indivíduos que albergam o vírus e não o sabem.

A infecção pode dar-se por contacto sexual ou transfusão de sangue, estando este contaminado. Pode, ainda, transmitir-se no contacto com seringas infectadas no caso dos toxicodependentes (Kuby, 2003).

 

Impacto global do HIV/SIDA

Vinte anos passados desde que se identificou o primeiro caso, a epidemia HIV/SIDA tem continuado a exceder todas as espectativas tanto em termos de severidade como da dimensão do impacto.

Em 1991, o então Programa Global para a SIDA da Organização Mundial de Saúde previu que, em 2000, a infecção global atingiria cerca de 40 milhões de pessoas (homens, mulheres e crianças). Na realidade, esta previsão tinha o seu fundamento. Hoje em dia, estima-se que cerca de 36 milhões de pessoas se encontrem infectadas com o vírus HIV e que aproximadamente 20 milhões já morreram devido à doença, originando um número, com tendência crescente, de 56 milhões de pessoas.

A região onde a epidemia atingiu maiores dimensões é a região Sub-Sahariana (África) onde, até ao fim do ano 2000, existiam cerca de 25.3 milhões de pessoas infectadas, atingindo já, cerca de ¾ da mortalidade global provocada por esta doença (fig. 5):

 

Fig. 5  – Números mundiais de adultos e crianças infectadas com o HIV (Piot et al, 2001)

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Tal como o facto da disseminação do HIV ser maior do que as previsões realizadas em décadas anteriores, também o impacto demografico, social e económico tem seguido os mesmos passos.

O decorrer da doença nos indivíduos infectados, mesmo nos que apresentam quadros clínicos promissores no que diz respeito à eficácia e acessibilidade de tratamento, provoca um profundo impacto nas expectativas de vida futuras e no crescimento económico. A SIDA constitui uma das maiores crises que defronta o desenvolvimento humano e parece reverter o progresso em muitos dos países afectados pela doença, ao longo dos tempos.

Se o número de novas infecções continuar a aumentar à velocidade actual, o impacto futuro será devastador. Existiam 5,3 milhões de novas infecções, em termos globais, em 2000, existindo um potencial evidente para uma disseminação massiva.

Esforços no sentido de prevenir a disseminação da doença têm sido aplicados nos países industrializados verificando-se uma expansão mais lenta da epidemia tornando-se, mesmo assim, implacável nos países mais vulneráveis.

Felizmente, existem alguns exemplos de sucesso que têm desafiado esta tendência. A Australia apresenta um record de sucesso na prevenção da disseminação da doença no que diz respeito aos toxicodependentes, actuando a nível de troca de seringas e agulhas e na consciencialização para a mudança de comportamentos e introdução de normas referentes à partilha das mesmas.

No entanto, à medida que a infecção vai progredindo, as condições que, sistematicamente, promovem vulnerabilidade ao HIV vão-se acentuando, incluindo a pobreza, desigualdade e migração, as duas últimas causadas e desenvolvidas em conflitos e guerras civis (Piot et al, 2001).

Estudos realizados na África Central e Ocidental demostraram que a prevalencia de seropositivos nas zonas rurais e urbanas não é a mesma. Existe uma discrepancia entre eles para qualquer faxa etária tendo-se atingido a faixa dos 25-40 anos uma discrepancia máxima de cerca de 30% de seropositivos na zona urbana para 5% na zona rural. As diferenças observadas são devido, principalmente aos militares e camionistas, mas maioritariamente pelas prostituição. Estas mulheres movem-se frequentemente de locais para outros devido às diversas pressões económicas, transportando o vírus consigo, não tomando as devidas precauções. Além do mais, a industrialização e o rápido crescimento citadino facilitaram a disseminação do vírus (fig.6) (Quinn, 1994):

 

Fig.  6 -  Prevalência do HIV, por faxas etárias, nas zonas rurais e urbanas (Quinn, 1994)

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Constituição genómica e estrutural do HIV

O genoma do vírus HIV é codificado por uma molécula simples de RNA (existindo duas cópias em cada partícula viral) de aproximadamente 10 Kb de comprimento (10000 bases nucleotídicas), que codifica 16 proteínas distintas. Estas proteínas, que derivam dos genes gag (group-specific antigen), pol (polimerase) e env (envelope), são componentes estruturais e enzimáticos requeridos por todas as retroviroses. Além destas proteínas, o HIV codifica, também, duas proteínas reguladoras, o transactivador transcripcional (Tat) através do gene tat e o regulador da transcrição do gene viral (Rev) mediante o gene rev (fig. 7) (Frankel, 1998):

 

Fig. 7 - Organização genómica do HIV (Peterlin et al, 2003)

 

O vírus contém, ainda, quatro genes que codificam as proteínas denominadas de acessórias sendo estas o Nef (“negative effector”), Vif (“viral infectivity factor”) e as proteínas Vpr e Vpu (proteínas virais r e u, respectivamente).

No que diz respeito às proteínas virais, estas são sintetizadas por mais de trinta espécies diferentes de RNA mensageiro (oito dos quais estão representados na fig. a) derivando, todos, do mesmo transcripto primário. No entanto, enquanto a maioria dos genes codificantes das proteínas reguladoras Tat e Rev e ainda do Nef sofrem o processo de splicing completo, os genes referentes às proteínas virais ou não sofrem splicing ou são, apenas, singly spliced (fig.7) (Frankel, 1998).

Os precursores das proteínas Gag, Env e Pol referidas são, numa segunda fase, processadas proteolíticamente por uma protease viral, dando origem aos vários componentes da partícula viral originando nove sub-unidades que correspondem a proteínas comuns a todos os membros da família dos retrovírus. Assim, depois de processadas, cada uma origina um componente essencial para a constituição viral. Assim, o Gag origina a matriz (MA), a capside (CA), a nucleocapside (NC) e a p6 (proteína que constitui o núcleo interior (inner core) da particula viral). Por outro lado, derivados do processamento da poliproteína Env, o gp120 (superfície, SU) e o gp41 (transmembrana, TM) constituem as proteínas da membrana viral exterior. Por fim, a poliproteína Pol origina os enzimas virais protease (PR), transcriptase reversa (RT) e integrase (IN), todos eles encapsulados no núcleo viral.

Sumariamente, a partícula viral é constituída por um núcleo capsulado contendo duas cópias do genoma viral (ssRNA) e os enzimas necessários à replicação, estando envolvido por um envelope viral (fig.8) ((Frankel, 1998; www.hcollege.com):

 

Fig. 8  – Diagrama esquemático do HIV (corte transversal) (Freed, 1998)

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Existem, ainda, as LTR’s (long terminal repeats) cuja actividade regula a expressão do genoma viral. As LTRs contêm elementos que interactuam com os mecanismos transcripcionais básicos da célula hospedeira (basic transcriptional machinery) (www.hcollege.com).

Ciclo de vida do HIV

Depois de se dar a infecção, o HIV dissemina-se por todo o organismo encontrando e ligando-se a potenciais células hospedeiras tais como macrófagos, células dendríticas ou linfócitos T “helper”. Todas estas células têm em comum o facto de expressarem um receptor proteico denominado CD4, existindo este na superfície celular. A ligação da partícula viral à membrana celular, nomeadamente à molécula CD4, é proporcionada pela glicoproteína gp120 existente à superfície do envelope viral. A interacção inicial do gp120 com a molécula CD4, só por si, não é suficiente para se concretizar a entrada do vírus na célula. Esta ligação apenas promove uma mudança da estrutura da molécula gp120, de modo a expor o local de ligação ao co-receptor. Uma vez ligados (o co-receptor e o CD4) pela acção do gp120, a proteína viral transmembranar gp41 muda, também, de conformação  de modo a facilitar a fusão membranar com a consequente entrada do vírus na célula (fig. 9):

 

a)

b)

Fig. 9 –  a) Esquema da ligação viral à superfície celular demostrando o papel das moléculas CD4, co-receptores, gp120 e gp41 (www.aids101.com/genetics);

b) Imagem de uma partícula de HIV a infectar uma célula (www.aids101.com/genetics).

 

Existem duas grandes classes do HIV-1 diferenciadas pelo tipo de células hospedeiras às quais se ligam e infectam. Esta selectividade é controlada pelo co-receptor pelo qual o gp120 se liga. Os viriões M-tropicos (estirpes R5) ligam-se, preferencialmente, ao receptor quimocina CCR5 existentes nos macrófagos, enquanto que as partículas virais T-tropicas (estirpes X4) apresentam uma maior afinidade para o receptor quimocina CXCR4 ou para a proteína fusina, existente nas células T. No entanto, na fase inicial da infecção, apenas as estirpes R5 são detectadas em indivíduos infecatdos. Muitos outros co-receptores têm sido identificados e, provavelmente, muitos serão descobertos no futuro (Finzi, 1998; www.hcollege.com).

Uma vez no interior da célula hospedeira, o núcleo viral (core) é liberto do seu envelope glicoproteico, expondo o material genético do vírus constituído por duas moléculas de RNA, pelos enzimas transcriptase reversa (RT), integrase (IN) e protease (PR), pela matriz proteica e pelo gene Vpr (www.hcollege.com). No passo seguinte, o enzima RT e enzimas do próprio hospedeiro catalisam a conversão do RNA viral em DNA. Deste modo, a RNA polimerase celular é activada por duas sequências localizados nos dois terminais do genoma do vírus. Estas “áreas” são denominadas de “long terminal repeats” (LTR’s). Estes, por sua vez, são activados por proteínas que se ligam a estas sequencias controladoras. Algumas destas proteínas de sinalização pertencem à família das proteínas conhecidas como NF-KB/Rel. Pensa-se que o HIV utiliza as proteínas NF-KB/Rel resultantes da activação das células imunitárias para auxílio à sua própria transcrição. Dá-se, portanto, a transcrição do material genético do vírus.

Uma vez transcripto, o material genético entra no núcleo da célula hospedeira onde é integrado no material genético da mesma. O enzima IN catalisa este processo, estando os seus bloqueadores em estudo de modo a encontrar uma maneira viável de bloquear a replicação do HIV.

Já integrado no material genético do hospedeiro, existe a possibilidade de o HIV permanecer no estado de latência durante muitos anos. Para se “esconder” do sistema imunitário, o vírus deixa de efectuar a espressão proteica, não havendo, assim, sinal da sua presença. Esta propriedade constitui uma das maiores barreiras para a cura da SIDA. É por esta razão que os portadores do HIV devem manter uma terapia anti-viral para o resto da vida (Finzi, 1998; www.aids101.com/genetics).

Como resultado do metabolismo natural do hospedeiro, o DNA viral é transcripto em RNA mensageiro (mRNA) que posteriormente origina as proteínas virais. O novo RNA viral forma o material genético das seguintes gerações de viroses. Uma vez integrado no genoma do hospedeiro, o provirus actua como um gene humano normal com o início da transcrição no terminal 5’ e o seu fim no terminal 3’. Além do mais, as LTR’s contém enhancers e promotores com locais de ligação para vários factores de transcrição e para sinais de poliadenilação (Jones, 1994).

É o processo de splicing que determina que porção de RNA constitui o material genético e qual será utilizado para a obtenção das proteínas virais. Assim, as cadeias de RNA que sofrem splicing tranformam-se em mRNA que posteriormente é utilizado na formação das proteínas. As cadeias de RNA que não sofrem splicing constituem o material genético dos vírus futuros sendo encapsidados, ficando, assim, aptos para deixar da célula hospedeira.

Numa descrição mais pormenorizada, duas fases distintas pertencentes ao processo de transcrição ocorrem após a infecção de uma célula individual. Na primeira fase, também chamada de “early phase”, que dura aproximadamente 24 horas, as cadeias de RNA formadas no nucleo da célula são clivadas em multiplas cópias de sequências curtas através dos enzimas do processo de splicing. Quando estas sequências chegam ao citoplasma, apenas apresentam 2000 nucleótidos de comprimento. São precisamente estas sequências que codificam as proteínas virais reguladoras. Na segunda fase, denominada de “late phase”, duas porções de RNA são transferidas do núcleo do hospedeiro para o seu citoplasma. Uma das porções (correspondente a longas sequências que não sofreram splicing), constituídas por 9749 bases, são o novo genoma viral e a outra porção (que sofreu splicing) constituída apenas por 4500 bases, codifica tanto as proteínas estruturais como as enzimáticas constituintes do HIV.

Após este processo, e ainda dentro da célula hospedeira, o RNA viral e as proteínas juntam-se à membrana celular de modo a originar um novo vírus. De entre os enzimas virais encontra-se a protease, sendo esta necessária para processar as outras proteínas do HIV de modo a obter as suas conformações funcionais. Os inibidores do protease, um dos mais potentes tipos de medicamentos anti-virais, actuam bloqueando este processo crítico de maturação (www.aids101.com/genetics).

A menos que o ciclo de vida do HIV seja interrompido devido a algum tratamento, a infecção espalha-se por todo o organismo resultando na destruição do sistema imunológico (fig.10):

 

Fig. 10 – Abordagem global do ciclo de vida do HIV (Peterlin, 2003)

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HIV-1 e terapias anti-virais

A conferência de Berlim, em 1993, marca o ponto inicial nas pesquisas das drogas anti-HIV. Aproximadamente uma década depois de se ter desvendado o HIV como sendo o causador da SIDA, apenas três drogas anti-HIV entraram no mercado: AZT, ddI e ddC, todos eles, actuando ao nível da transcriptase reversa. Na melhor das hipóteses, estas drogas apenas acrescentam poucos anos de vida adicionais. Durante 1996, uma combinação de inibidores de RT e de novas drogas (que têm como alvo as proteases do HIV) mudaram radicalmente as esperanças dos indivíduos infectados (Cohen, 2002).

A transcriptase reversa foi o primeiro alvo das drogas antivirais usadas clinicamente sendo o enzima protease o segundo alvo devido ao facto de quebrarem as proteínas precursoras durante a formação das partículas virais. Outros alvos promissores para o desenvolvimento das drogas antivirais incluem a interacção superfície celular/receptor e a interacção do DNA viral/DNA cromossomal da célula hospedeira (tabela  I):

 

Tabela  I - Lista de algumas das drogas antivirais e respectivo alvo (Cohen, 2002)

 

Com o aparecimento da terapia denominada de HAART (highly active anti-retroviral therapy) em 1996, a ideia de cura para a infecção do HIV foi discutida seriamente pela primeira vez. O conceito é bastante linear: interromper o ciclo vicioso do vírus, bem como o seu elevado nível de replicação por um tempo suficiente que permita a morte dos linfócitos cronicamente infectados (Saag et al, 1999). Esta terapia consiste na combinação de, pelo menos, três drogas anti-retrovirais e usualmente inclui, pelo menos, uma droga das classes dos inibidores das proteases. Esta terapia destina-se a indivíduos infectados com o HIV, constituindo um passo importante no controlo e replicação viral. A aplicação desta terapia mudou dramaticamente o decorrer da infecção em muitos indivíduos infectados, levando a um declínio substancial na incidência da SIDA e da mortalidade associada nos países desenvolvidos.

Estudos efectuados demonstraram um considerável optimismo pelo facto de o HIV poder ser erradicado em indivíduos infectados, sendo sujeito ao tratamento HAART. Este optimismo é baseado no modelo matemático da cinética do decaimento viral no plasma de indivíduos infectados pouco depois do início da terapia (fig. 11):

 

Fig. 11 – Curva do decaimento hipotético das partículas virais no pasma em pacientes sujeitos à terapia HAART (Finzi et al, 1998)

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Infelizmente, tem-se provado que estas suposições não estão totalmente correctas sendo a maior preocupação  a incerteza de se poder dar ou não a erradicação do vírus pela aplicação desta terapia. Um dos aspectos mais desencorajantes na erradicação do HIV é a existência de linfócitos T CD4+ infectados e latentes, contendo a capacidade de replicação do HIV. Estas células podem ser comparadas a grandes reservatórios do vírus. No final de 1997, investigadores demonstraram que uma pool de células das quais o vírus pode ser isolado persiste essencialmente em indivíduos infectados que estão sujeitos ao tratamento referido por períodos consideráveis de tempo (à mais de três anos) e nos quais a virose foi reduzida a valores situados abaixo dos níveis de detecção dos métodos mais sensíveis (Chun et al, 1999). No entanto, estudos efectuados demonstraram que a erradicação destes reservatórios pode levar décadas para se concretizar implicando, portanto, que os pacientes tenham de manter a terapia durante toda a vida (Cohen, 2002).

Quando uma potente combinação terapêutica é administrada eficazmente, os níveis de RNA viral no plasma e de células infectadas no tecido linfóide decaiem rapidamente. Este decaimento primário é atribuído à morte celular de linfócitos CD4 activados e infectados e à prevenção de novas infecções. A velocidade de decaimento secundário é baixa, apresentando grande variabilidade entre os indivíduos. Este facto tem sido atribuído ao desaparecimento de macrófagos infectados ou a viriões ligados a células dendríticas nos módulos linfóides, podendo, também, ser devido a linfócitos CD4 infectados de modo crónico, com um tempo de meia vida longo e baixas velocidades de replicação viral. O facto de não se conseguir reduzir o RNA viral para valores abaixo das 50 cópias/cm3 plasma (limite de detecção dos métodos analíticos disponíveis) é indicativo de uma supressão inadequada e de risco de aparecimento de vírus resistentes.

No que diz respeito aos efeitos secundários, nenhuma droga é isenta de toxicidade. Quando drogas anti-retrovirais foram introduzidas pela primeira vez, os riscos e toxicidades foram toleradas devido ao facto de a doença ser bastante devastadora. As terapias crónicas prolongadas e o desaparecimento dos sintomas comuns da doença têm permitido identificar e caracterizar complicações adversas das drogas anti-retrovirais. Por exemplo, os inibidores das proteases têm estado intimamente relacionadas com a intolerância à insulina e ao aumento dos níveis do colesterol e dos triglicéridos (Richman, 2001).

Baseado nas taxas iniciais de decaimento numa cultura de células HIV-1 positivas (com um tempo de meia vida de cerca de duas semanas) para células cronicamente infectadas, sugeriu-se que a eliminação total destas células possa ser adquirida num prazo de três a quatro anos de tratamento contínuo.

Este tratamento é baseado em dois factores importantes:

        I.      O bloqueio completo da replicação do HIV foi possível com terapias correntes;

      II.      A pool de células de vida curta relacionada era o único reservatório do vírus activo;

O conceito de erradicação viral foi alterado seriamente em 1997, quando alguns laboratórios demostraram a persistência de linfócitos CD4+ infectados em indivíduos  apresentando uma supressão prolongada do RNA viral que circula no plasma, incluindo pacientes que foram tratados durante o tempo de seroconversão (um grupo de indivíduos que se pensa terem maiores probabilidades de cura).

Estudos efectuados evidenciaram um tempo de meia vida maior deste tipo de células (T-CD4+) em relação ao previsto, englobando um período de seis a quarenta e quatro meses. Além disso, investigadores do ADARC (Aaron Diamond AIDS Research Center) observaram o progresso da replicação, embora num nível baixo, mesmo em indivíduos apresentando níveis persistentes e não detectáveis de RNA viral no plasma (< 50 cópias) durante vinte a trinta meses.

Medições da frequência de células positivas durante o decorrer da terapia anti-retroviral foram efectuadas em vinte pacientes, revelando um decaimento extremamente pequeno deste tipo de células, com declives aproximadamente zero. Este facto implica um tempo de meia vida, para estas células, estimado em cerca de 43,9 meses. No entanto, existe alguma incerteza estatística nestas previsões (Saag et al, 1999).

Um dos problemas relacionados com as terapias aplicadas é a resistência viral provocada por descontinuidades nos tratamentos efectuados. Aproximadamente dez biliões (1010) viriões de HIV-1 são gerados diariamente com uma velocidade de mutação de cerca de 105 nucleótidos por ciclo de replicação. A incompleta supressão da replicação viral, a uma escala que exerça pressão suficiente, conduz à evolução e fixação de vírus resistentes às drogas a uma velocidade elevada.

À medida que as mutações se vão acumulando, a susceptibilidade às drogas diminui, reduzindo, progressivamente, a eficácia dos medicamentos usados. Os novos regimes recomendados aos pacientes com resistência anti-viral não só podem levar a uma resistência ainda maior como também encontram pela frente os mesmos obstáculos que o primeiro tratamento (Richman, 2001).

Apesar de os custos dos tratamentos para o HIV terem vindo a baixar desde a introdução do AZT, nos Estados Unidos, o tratamento ronda os US$20,000 por paciente e por ano, na altura em que foram inseridos no mercado os inibidores das proteases, em 1995. À medida que se dava o aparecimento de terapias cada vez mais potentes e cara, os cuidados de saúde decaíram. Apesar de estes tratamentos apresentarem um custo standard de US$10,000 – 15,000 por ano, a maioria dos países desenvolvidos não conseguem suportar as despesas para a obtenção de quantidades suficientes de drogas.

No entanto, as barreiras económicas não estão apenas confinadas aos países desenvolvidos. Mesmo os Estados Unidos, onde se verificou uma redução de 80% na mortalidade com a aplicação dos tratamentos optimizados, as pessoas de poder socioeconómico baixo ou com comportamentos emocionais específicos têm dificuldade em aceder às terapias adequadas (Richman, 2001).

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Abordagem humoral sobre o HIV

O sistema imunitário responde a cada antigénio particular pela produção de anticorpos específicos. Quando um antigénio entra no organismo e atinge um órgão linfóide, irá estimular uma pequena fracção de linfócitos B geneticamente específicos para esse antigénio (Kuby, 2003). Assim, estes sofrem um rápido processo de divisão, produzindo-se grandes quantidades de anticorpos específicos.

Os anticorpos não têm a capacidade de destruir directamente os invasores portadores de antigénios. Na verdade, eles “marcam” as moléculas estranhas que posteriormente são destruídas depois de uma série de processos, verificando-se, entre outros, a activação do complemento (Silva et al, 1998; Purves et al, 1995; Kuby, 2003).

De um modo geral, pacientes infectados com o HIV-1 demonstram uma elevada concentração de anticorpos direccionados para as diferentes proteínas virais, nos três primeiros meses após a infecção. No entanto, grande parte desta resposta imunológica é direccionada específicamente para as partículas virais, não apresentando um efeito antiviral eficiente.

A identificação dos antigenios do HIV-1 capazes de incitar a acção dos anticorpos é uma ferramenta importante para definir o potencial da resposta imunitária humoral controladora de replicação do HIV-1 (Fouts et al, 1997). Até hoje, muitos epitopos contínuos e descontínuos das glicoproteínas gp120 e gp41 do envelope glicoproteico do HIV-1 têm mostrado estimular os anticorpos neutralizantes. Assim, os primeiros anticorpos a serem detectados na primeira fase da infecção apresentam especificidade para alguns determinantes antigénicos das proteínas estruturais do HIV-1 tais como o p24 e o p17 da proteína Gag bem como antigénios relacionados com as proteínas regulatórias e acessórias como Ver, Tat, Vpr, Vpu, Vif e Nef.

No entanto, os anticorpos neutralizantes, aqueles que neutralizam o vírus mesmo antes da sua entrada nas células, são direccionados, maioritariamente, para o envelope glicoproteico. Assim sendo, muitos destes anticorpos são específicos para uma região hipervariável denominada de loop V3, sendo esta característica da sub-unidade gp120 da proteína Env (Parren et al, 1999). Este determinante antigénico é crítico na fase da infecção uma vez que representa o local específico do vírus que se liga aos receptores proteicos envolvidos na infecção, mostrando-se, esta estrutura, flexível (Tsang, 2000). De um modo geral, a ligação dos anticorpos ao gp120 monomérico é um indicativo fraco da neutralização primária viral. Para alguns mAbs, os que reconhecem os epitopos dos domínios N e C-terminais do gp120, a explicação é razoavelmente clara: o epitopo está inacessível devido ao facto de estar localizado numa região do gp120 que está associada com outros componentes do complexo oligomérico. Para os outros mAbs, os que reconhecem epitopos situados acima do local de ligação do CD4, a explicação não é tão evidente. No entanto, estudos in vitro continuam a demonstrar algum grau de ligação, tanto à estrutura monomérica como oligomérica do envelope bem como uma neutralização significativa dos epítopos utilizados, sendo esta indicativo do grau de neutralização viral (fig. 12) (Fouts et al, 1997).

Neste contexto, apenas dois epitopos do gp120 têm sido considerados como claramente acessíveis na maioria dos isolados primários. Estes epitopos são específicos dos anticorpos monoclonais b12 e 2G12 humanos, cuja acessibilidade foi inferida das propriedades de neutralização e, mais recentemente, de estudos de ligação.

 

Fig. 12 – Modelo esquemático da exposição dos epítopos nos isolados gp41, gp120 e no oligómero maduro (Weissenhorn, 1997; Sodrosky, 1996; Poignard, 1996, Burton, 1997)

 

O anticorpo recombinante b12 caracteriza um epitopo no domínio de ligação ao CD4 e é influenciado pelo loop V2. O poder neutralizante contra a maioria dos isolados primários constitui uma mais valia. Por exemplo, num método para determinar a redução da infecção, 25 mg/ml de b12 neutraliza eficientemente 35 dos 35 isolados primários, incluindo isolados de uma vasta área geográfica. Já o 2G12 define um epitopo contendo resíduos perto da base do loop V3 (C2 e C3) e da região V4.

A ligação do anticorpo é sensível a mudanças ocorridas nos locais de N-glicosilações. Não está claro que o epitopo 2G12 seja inteiramente peptídico ou influenciado pela presença de carbohidratos ligados ao terminal amina ou se envolve directamente carbohidratos.

O anticorpo F105, por sua vez, reconhece um epitopo descontínuo do HIV-1 que se situa acima do local de ligação do CD4 e o anticorpo 17b liga-se a um epítopo descontínuo do gp120 situado a seguir ao local de ligação da molécula CD4 (Wu et al, 1996).

Pensa-se que outros epitopos existentes no gp120 tenham acessibilidade limitada em alguns isolados primários perante as propriedades de neutralização dos mAbs. Tais epitopos não desempenham funções importantes no design de vacinas.

Em suma, têm sido documentados muito poucos epitopos acessíveis, existentes no envelope glicoproteico. A natureza oligomérica das proteínas do envelope, juntamente com a elevada e extraordinária glicosilação do gp120 provavelmente contribui para este reduzido número de epitopos acessíveis.

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Perspectivas de desenvolvimento de futuras vacinas

A protecção contra doenças virais têm sido associadas, tradicionalmente, à pré-existência de anticorpos no soro, capazes de neutralizar os vírus in vitro. De facto, as vacinas são produzidas com base na capacidade de estimular respostas neutralizantes por parte dos anticorpos.

Novas ferramentas moleculares em virologia e em imunologia, novos adjuvantes, novos sistemas de expressão genética, descobertas recentes da infecção e patogénese do HIV e estudos promissores de hipotéticas vacinas em animais têm proporcionado argumentos suficientes para o desenvolvimento de uma vacina para a SIDA, segura e eficaz. No entanto, tem-se constatado que tal não foi, ainda, possível e que a complexa biologia do HIV torna a tarefa ainda mais complicada.

Apesar de existiram alguns determinantes antigénicos acessíveis, não se verifica, no entanto, uma resposta imunológica eficiente. Tal facto é devido à extraordinária capacidade do vírus para ludibriar o sistema imunológico. Assim, a extrema adaptabilidade das retroviroses é uma vantagem conferida, em parte pelo enzima transcriptase reversa, o que origina uma elevada gama de mutações a cada ciclo de replicação viral (Bebenek et al, 1993). Além do mais, este enzima apresenta a capacidade intrínseca de “saltar” entre as cadeias durante a sintese do DNA, levando a altas taxas de recombinação entre RNA’s celular e viral e entre diferentes regiões do genoma viral (Telesnitsky et al, 1997). Acoplados a estes factores estão, ainda, outros relacionados com a replicação viral como transições, transversões, inserções, delecções e duplicações que ocorrem e alteram a sequencia viral. Outra das estratégias utilizadas pelo vírus na ludibriação do sistema de defesa é o grau de glicosilação do envelope viral, apresentando este cerca de 28 locais de glicosilação. Está, ainda, demostrado que a glicosilação tem a capacidade de modular, imunogenicamente e antigenicamente, a superfície proteíca viral. Tal facto, altera completamente a exposição dos determinantes antigénicos a uma taxa considerável o que dificulta muito a formação de uma resposta humoral eficiente.

Existem muitos parâmetros inerentes à resposta imunitária induzida pela vacinas que determina a sua maior ou menor capacidade para proteger o hospedeiro da infecção e da doença. De entre estes encontram-se a especificidade, as propriedades funcionais, a magnitude e a compartimentalização. No entanto, o factor mais relevante é o tempo. A duração da resposta imunitária relacionada à infecção inicial e disseminação do vírus é particularmente  importante  no caso da infecção pelo HIV-1. De facto, quanto maior for o grau de replicação viral no hospedeiro menores serão as probabilidades de o sistema imunológico reagir contra as adversidades promovidas.

No que diz respeito ao HIV-1, tem sido difícil de produzir vacinas capazes de provocar respostas de anticorpos que neutralizem a grande variedade de estirpes de vírus encontrados nos pacientes. As respostas dos linfocitos T citotóxicos podem ser capazes de fazer frente a uma grande variedade de estirpes de vírus e parecem ajudar a controlar o HIV-1 em pessoas infectadas e, por isso,  as atenções  hoje centram-se nas vacinas capazes de produzir respostas pelos Linfócitos citotóxicos (Lifson et al, 2002).

Tanto a imunidade celular como a imunidade humoral diminuem com a progressão da infecção VIH e a capacidade para produzir anticorpos específicos após uma infecção ou imunização fica progressivamente pior. É pois importante que a vacinação seja dada tão cedo quanto possível no decurso duma infecção pelo HIV. Por outro lado, em doentes que se apresentem com uma situação de imunodeficiência avançada é preferível adiar a vacinação até que seja iniciada terapêutica antiretroviral para maximizar o efeito da vacina. As vacinas de vírus vivos ou atenuados não devem ser dados a pessoas infectadas pelo HIV.

Apesar do optimismo de alguns investigadores sobre uma vacina contra a SIDA disponível dentro de 10 anos, é improvável que esta seja totalmente eficaz contra todas as estirpes do vírus. Existem dezenas de protótipos vacinais em desenvolvimento em todo o mundo, com cerca de 9 000 indivíduos envolvidos em ensaios clínicos.

A vacina mais avançada em testes é a GP-120, desenvolvida pela empresa de biotecnologia VaxGen, desenvolvida a partir da proteína da superfície viral (gp120) que estimula a produção de anticorpos neutralizadores. Os ensaios estão a ser realizados na Tailândia, América do Norte, e Holanda, podendo os resultados estar disponíveis dentro de algum tempo. Caso estes sejam prometedores, será realizado outro ensaio alargado, que decorrerá ao longo de 3 anos.

A título de curiosidade existem vários investigadores a trabalharem na descoberta de uma vacina capaz de neutralizar o HIV. Por exemplo, o Dr. Renshaw da Austrália, está a trabalhar num tipo de vacina terapêutica na qual a primeira inoculação é uma dose completa de DNA do HIV, a pessoas que já estão a tomar HAART. As experiências com macacos provaram que a inoculação de DNA viral nos animais já infectados a fazer tratamento, provoca uma reacção imunológica positiva. Outro exemplo é o caso do pediatra Johnson, dos EUA, que está a desenvolver uma vacina preventiva de DNA que utiliza uma vacina associada ao vírus da gripe comum. Este vírus é bastante apreciado porque pode ser facilmente manipulado por forma a conter outras estirpes virais e move-se rapidamente na corrente sanguínea. Também David Knipe, de Harvard, está a trabalhar em vacinas preventivas e espera desenvolver uma que ataque o HIV e o herpes genital. O seu grupo vai começar os ensaios clínicos da vacina do herpes genital, daqui a 12 meses. E enquanto isso, ele e o seu associado Ronald Desrosiers vão continuar a estudar uma maneira de incluir o DNA do VIH nessa vacina do herpes. Até agora, já testaram em macacos, tendo conseguido uma resposta imune nos 7 macacos estudados, e uma "resposta protectora em 3 dos 7 (www.aidsportugal.com; 1ª conferência internacional sobre vacinas e imunoterapia).

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HIV: Efeitos sobre a resposta celular

O termo imunidade mediada por células [“cell-mediated-immunity” (CMI)] foi atribuído para descrever o conjunto de reacções específicas que se processam sobre entidades “estranhas” (como por exemplo, patogénicos intracelulares)e que são mediadas por linfócitos e fagócitos, em vez de serem mediadas por anticorpos, como no caso da resposta humoral (Roitt et al., 1996).

Contudo, mais vulgarmente, a designação de resposta celular é atribuída, geralmente, a todos os tipos de respostas contra essas entidades, tumores, etc. sobre as quais os anticorpos desempenham um papel secundário (Roitt et al., 1996).  

No entanto, torna-se impossível, hoje em dia, discriminar perfeitamente aquilo que é uma resposta humoral e aquilo que é uma resposta celular. Pois, por um lado, as células estão envolvidas na iniciação das respostas humorais, por outro, os anticorpos desempenham um importante “elo” de ligação entre algumas respostas mediadas por células. Mais ainda, é muito pouco provável que qualquer resposta celular ocorra na ausência total de anticorpos, cuja função lhes permite modificar a resposta celular de formas muito variadas (Roitt et al., 1996).

Figura 13- Perspectiva geral da interacção entre a resposta humoral e a celular. Na resposta humoral, as células B interagem com o antigénio, diferenciando-se em células plasmáticas secretoras de anticorpos. O anticorpo secretado liga-se ao antigénio e facilita a sua “clearance” do organismo. Na resposta mediada por células, várias subpopulações de células T reconhecem o antigénio apresentado pelas células do “próprio”. As células TH respondem ao antigénio através da produção de citoquinas, ao passo que as células TC respondem desenvolvendo-  -se em linfócitos citotóxicos (CTLs), que provocam a destruição de células do “próprio”, por exemplo, células infectadas por vírus. Adaptado de Kuby, 2003.

 

Por exemplo, a formação de complexos antigénio-anticorpo, du-rante uma resposta imunitária, conduz à libertação de fragmentos quimiostáticos do complemento que por sua vez, provocam a acumulação de células e inflamação. Os anticorpos podem igualmente estar envolvidos na ligação de antigénios às células, via receptores celulares Fc, modelando assim a resposta celular. No caso das células fagocitárias e das células citotóxicas, os anticorpos podem contribuir para ligá-las aos respectivos “alvos” (Roitt et al., 1996).

Todavia, também não deve ser igualmente assumido que todas as respostas celulares são dependentes da função dos linfócitos T. Pois, muitas das reacções de defesa iniciais, aos microrganismos, dependem do reconhecimento específico, dos constituintes comuns dos micróbios, por parte de receptores diferentes daqueles existentes em células T e B (Roitt et al., 1996).

A resposta celular às viruses incluiu a intervenção simultânea dos linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) e dos linfócitos T CD4+ auxiliares. Os CTLs reconhecem os antigénios virias que foram processados intracelularmente em péptidos. Estes péptidos, com habitualmente 8 a 11 aminoácidos de comprimento, são posteriormente apresentados, em conjunto com o complexo de histocompatibilidade do tipo I (MHC class I) e com a microglobulina b2, pelas células infectadas.

 

Figura 14- Reconhecimento do péptido viral, pelo receptor CD8+ das células T e pelo CD4+ do linfócito T auxiliar, adaptado de (Gandhi e Walker, 2002).

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O receptor CD8+ das células T reconhece o complexo formado pelo MHC tipo I, pela b2 microglobulina e pelo péptido viral.

Este reconhecimento desencadeia o processo de lise celular da  célula infectada, por parte das CTLs, como se pode observar na figura.

Para além da função citolítica, as células CD8+ também segregam citoquinas que possuem um efeito antiviral. Como exemplo, temos o interferão g (IFN g) e o factor de necrose tumoral a (TNF a). 

Contudo, como se referiu, as células CD4+ T auxiliares, também reconhecem o péptido viral, quando este se encontra conjugado com os MHC tipo II, localizados na superfície das células apresentadoras de antigénio. Após este reconhecimento a célula T auxiliar é activada para secretar linfoquinas que vão coordenar a resposta imunitária por parte das células CD8+ e das células B (Gandhi e Walker, 2002).

O isolamento do HIV-1 e o seu crescimento em cultura, permitiram a purificação de proteínas virais e o desenvolvimento de testes específicos para detectar a infecção pelo vírus. Desses testes, aquele utilizado com maior frequência, permite a detecção de anticorpos específicos contra as proteínas do HIV-1. Estas  últimas, surgem no soro dos indivíduos três meses após estes terem sido infectados. Após a detecção destes anticorpos específicos, o indivíduo diz-se seropositivo ao HIV-1 (Kuby et al., 2003).

Embora o decurso da infecção e respectiva doença varie de indivíduo para indivíduo, apresenta o padrão descrito pela figura apresentada.

O decurso da infecção do HIV-1 encontra-se compreendida entra duas situações extremas: inicia-se com uma quantidade não detectável de anticorpos anti-HIV-1 e/ou de vírus e progride até à SIDA (síndroma da imunodeficiência adquirida)

 

Figura 15- Perfil serológico da infecção do HIV, evidenciando três fases. Após a infecção começa a ser possível detectar a presença de anticorpos anti-HIV. No entanto, a infecção pelo HIV torna-se mais fielmente detectada após a seroconversão, que ocorre alguns meses após infecção. Todavia, os sintomas indicativos de SIDA não aparecem antes dos 8 após a infecção, sendo este intervalo variável. O ponto de viragem entre a fase crónica e a fase da SIDA é frequentemente assinalado pela diminuição do número de células T e um aumento da “carga ou quantidade viral”. Adaptado de A. Fauci et al., 1996, Annals Int. Med. 124 :654. Citado em Kuby et al., 2003

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A pesquisa, relativamente ao processo que descreve a progressão do HIV à SIDA,  tem revelado uma “batalha” dinâmica entre o vírus e o sistema imunitário (Kuby et al., 2003).

O fenómeno de infecção provoca uma disseminação e/ou propagação do vírus até aos órgãos linfoídes. Daqui resulta uma resposta imunitária “severa” que envolve anticorpos e linfócitos CD8+ citotóxicos.

Esta resposta adaptativa (celular e humoral) permite controlar a replicação viral. Após este “surto” inicial de virémia (elevados níveis de vírus em circulação), atinge-se um estado estacionário (velocidade de replicação viral = velocidade de destruição viral Þ acumulação = 0).

No entanto, apesar de o indivíduo infectado não apresentar, normalmente, nesta fase da doença, os sintomas da doença, o facto é que a replicação viral contínua (109 viriões.dia-1), podendo ser detectada por ensaios de PCR específicos. Estes ensaios de PCR, que quantificam a “carga ou quantidade viral” (“viral load”, número de cópias do genoma viral, presentes no plasma), assumem um papel fundamental no prognóstico do paciente (Kuby et al., 2003).

Apesar desta elevada taxa de replicação, o sistema imunitário do indivíduo, consegue ainda, durante um certo período de tempo (até +/- os 8 anos) “controlar” o vírus, (a) da figura 15, fase crónica da doença (Kuby et al., 2003).

Estudos de terapia retroviral, nos quais a “carga ou quantidade viral” diminui, devido ao tratamento aplicado, demonstraram um aumento nos números de linfócitos T CD4+, tal como se pode ver na figura** a seguir apresentada (b).

 

Fig.16- Produção de vírus pelas células T CD4+ e a manutenção do estado estacionário. (a) relação dinâmica existente entre o número de células T CD4+ e a quantidade de vírus produzidos. Quando os vírus são produzidos, novas células T CD4+ são infectadas, apresentando as mesmas um T1/2 = 1.5 dias. Na progressão da doença, até à fase da SIDA, a “carga ou quantidade viral” aumenta e o número de células T CD4+ diminui, até ao possível estabelecimento de infecções oportunistas. (b) No entanto, caso se aplique um tratamento anti-retroviral, a “carga ou quantidade viral” diminui e o número de células T CD4+ aumenta quase imediatamente, Adaptado de Kuby et al., 2003.

 

O fenómeno marcante, entre a fase crónica e a fase da SIDA, é a diminuição das células CD4+.

Num primeiro estudo referia-se, que a diminuição resultava da infecção e destruição directa das células CD4+, pelo vírus. Contudo, esta primeira hipótese foi posta de parte, pois o elevado de células CD4+ infectadas pelo vírus, previsto no modelo, nunca foi encontrado (Kuby et al., 2003).

Estudos posteriores mostraram que a dificuldade em encontrar células infectadas pelo vírus deve-se ao facto de estas serem rapidamente mortas, pois o tempo de meia-vida (T1/2) dos linfócitos T CD4+ infectados pode ser inferior a um dia e meio (Kuby et al., 2003).

Por fim, na fase da SIDA, os indivíduos infectados com o HIV perdem a capacidade de “montar” (construir) uma resposta celular através das células T. Essa incapacidade resulta na seguinte sequência: em primeiro lugar, perde-se a capacidade de resposta a antigénios específicos, por exemplo, os do vírus influenza, em seguida, a resposta a alloantigénios  (resultantes da variação genética interespecífica) diminui, em último lugar, a resposta a mitogénios (substâncias que provocam divisão celular, sobretudo nos linfócitos), como por exemplo, a concanavalina A e/ou a fitohemaglutinina, desaparece. A fase SIDA termina com a morte do indivíduo (Kuby et al., 2003).

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A fuga do HIV aos linfócitos T citotóxicos

Como já se referiu anteriormente, as células infectadas por vírus, processam e dispõem à superfície das mesmas, proteínas e/ou péptidos virais conjugadas com MHC de tipo I. Os CTLs do hospedeiro, específicos, reconhecem esses conjugados e provocam a destruição das células que os exibem (Johnson e Desrosiers, 2002).

No entanto, por via desta acção inicial dos CTLs, torna-se perfeitamente razoável e lógico, assumir que será a actividade destes CTLs que seleccionará e/ou deixará escapar as variantes virias cujo reconhecimento não foi possível. A “habilidade” de sequências peptídicas alteradas, “escaparem”, já foi demonstrada em estudos noutros retrovírus (Green e Smith, 1996; Ossendorp et al., 1996, citado em Johnson e Desrosiers, 2002) e demonstrada definitivamente na infecção experimental do rato com virose linfocítica coriomeningítica**, (“lymphocytic choriomeningitis virus”, LCMV, (Pircher et al., 1990, citado em Johnson e Desrosiers, 2002).

Todavia, é difícil obter fortes evidências deste acontecimento (“fuga” aos linfócitos T citotóxicos) em indivíduos infectados com o HIV-1 (Johnson e Desrosiers, 2002). Apesar dessas dificuldades, têm sido apresentados casos, demonstrados bioquimicamente, em que a alteração de epitopos parece ser fortemente restringida, reduzindo assim o reconhecimento de péptidos alterados (McMichael, 1998, citado em Johnson e Desrosiers, 2002).

A morte celular  - O processo apoptótico

A morte celular (apoptose) é um processo fisiológico bastante importante e altamente regulado que ocorre quando uma célula de um determinado organismo desenvolve um mecanismo orquestrado por certas proteínas codificadas no seu genoma. (Vaux et al, 1996) Assim, esta forma de morte celular encontra-se envolvida em diversos processos biológicos tais como a morfogénese, a renovação de populações celulares de vários órgãos e sistemas ao longo do período de vida dos organismos multicelulares, na eliminação de células anormais e na eliminação de células infectadas por um vírus (ou seja, funciona como um mecanismo de defesa), pelo que a apoptose é um processo fundamental para a manutenção da homeostasia dos organismos. Deste modo, o conhecimento detalhado dos mecanismos moleculares que regulam a vida/morte celular é um factor indiscutivelmente importante numa perspectiva de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas de actuação em relação a diversas situações patológicas, como por exemplo para o caso da SIDA (Azevedo et al, 1999) (Vaux et al, 1996)

Os primeiros estudos sobre o processo de morte celular demonstraram que os organismos unicelulares provocam a autodestruição através de um mecanismo cuja activação não é obrigatória, mas que pode ser utilizado em várias situações de risco. De facto, estes organismos autodestroem-se quando detectam a presença de um bacteriófago impedindo desta forma a propagação da infecção para o resto da colónia. Assim, e pelo facto do processo de morte celular ser semelhante aos mecanismos envolvidos no desenvolvimento e homeostasia dos metazoários, apesar do tempo de vida total do organismo não o ser, permite especular que o processo de morte celular desenvolveu-se em primeiro lugar nos organismos unicelulares como estratégia de defesa e, consequentemente, foi adoptado por organismos superiores no decurso normal da evolução da multicelularidade. (Vaux et al, 1996)

Geralmente, o processo apoptótico é acompanhado por várias alterações celulares típicas nas quais se incluem a condensação da cromatina, degra­dação internucleosómica do DNA em múltiplos de 180 bp (tamanho que corresponde ao espaço internucleossomal), destruição do citosqueleto, modificações da membrana citoplasmática com projecções em forma de bolha (blebs), exposição da fosfatidilserina na superfície membranar, terminando com a fragmentação celular em corpos apoptóticos, posteriormente degradados por fagocitose. (Azevedo et al, 1999) (Vaux et al, 1996) De facto, a detecção de fragmentos de DNA com este tamanho (a electroforese do DNA de células apoptóticas permite visualizar fragmentos com 180bp) ou, a redução do conteúdo total de DNA para valores inferiores a 2C, são factores indicadores que a célula em causa está a sofrer um processo de senescência e, por isso, estes aspectos são utilizados em várias técnicas experimentais para demonstrar que a apoptose está a decorrer. (Vaux et al, 1996) Com efeito, o termo apoptose foi originalmente proposto em 1972 para designar a forma de morte celular caracterizada pelas alterações morfológicas acima descritas. No entanto, foi apenas durante a última década que o signi­ficado bioquímico da apoptose como processo activo, componente essencial e participante perma­nente na vida dos organismos multicelula­res, se evidenciou e foi progressivamente aceite. ( Badley et al, 2000)

É actualmente aceite afirmar que du­rante o desenvolvimento embrionário, a mor­fogénese requer a perda celular por apoptose e que, uma vez completadas as etapas de desen­volvimento, a vida de um organismo depende da manutenção e da renovação de diferentes tipos celulares. Assim, a manutenção de populações estáveis, como os neurónios que permane­cem ao longo da vida de um indivíduo, implica um grau mínimo de apoptose, enquanto a renovação quase constante de outros tipos de células (como por exemplo nos linfócitos), implica um processo activo de morte celular, mas igualmente constante. Por outro lado, o funcionamento do sistema imuni­tário acarreta o desenvolvimento e a expansão de subpopulações de células linfóides de forma a viabilizar uma resposta contra os agentes exógenos ao organismo, sendo que o carácter transitório desta resposta depende também da perda activa, por apoptose, destas subpopulações celulares quando já desnecessárias.  Além disso, existem inúmeros agentes (físicos, químicos e biológicos) que podem provocar lesões celulares irreparáveis, sendo que as células irreme­diavelmente lesadas podem ser eliminadas por apoptose. Compreende-se assim, que a existência de ano­malias no processo apoptótico possam estar subjacentes a vários tipos de processos patológicos desde malfor­mações congénitas, doenças neurodegenera­tivas, disfunções imunológicas, podendo ainda contribuir para a persistência de células anormais facilitando o desenvolvimento de neoplasias. (Vaux et al, 1996) ( Badley et al, 2000)

O processo apoptótico, en­quanto morte celular programada, representa um processo intrínseco que, uma vez desenca­deado e independentemente dos estímulos de­sencadeadores, conduz sistematicamente a um tipo específico de destruição celular. Assim, a natu­reza intrínseca da execução apoptótica implica que a célula normal dispõe dos instrumentos necessários à sua desintegração. Por outras palavras, a capacidade de executar este pro­cesso de morte celular é parte do património genético das células. (Azevedo et al, 1999)

Os estudos efectuados em sistemas rela­tivamente simples na escala evolutiva têm aberto excelentes perspectivas e facilitado a abordagem experimental de vários fenómenos biológicos que ocorrem em sistemas mais com­plexos, como o caso dos mamíferos. (Azevedo et al, 1999)

Ao longo dos tempos, o nemátode Caenorhabditis elegans é reconhecido por fornecer um excelente modelo para o estudo do processo apoptótico pois os diversos estádios deste mecanismo podem ser observados durante o seu desenvolvimento. Por outro lado, a possibilidade de obtenção de animais mutantes desta espécie nos quais o processo em causa é irregular, permitiu a obtenção de dados genéticos acerca dos mecanismos de regulação do processo de apoptose ( genes ced =“cell death abnormal”). (Vaux et al, 1996)

Deste modo, os vários estudos moleculares efectuados com C. elegans modificados permitiram a identificação de vários genes envolvidos na regulação do processo apoptótico. Assim, os diversos genes identificados podem agrupar-se em: 1) genes responsáveis por desencadear a apoptose; 2) genes envolvidos no próprio pro­cesso apoptótico; 3) genes necessários para que os "corpos apoptóticos" sejam fagoci­tados; 4) genes necessários para a dissolução final dos corpos apoptóticos fagocitados. (Azevedo et al, 1999)

 

Fig. 17- Componentes do processo apoptótico no C. elegans. Nos diferentes grupos de genes envolvidos, note-se, em particular, que o processo é dependente das proteínas codificadas pelos genes ced-3 e ced-4, sendo bloquedo pelo produto codificado no gene ced-9; (Hale et al, 1996)

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Deste modo, no modelo fornecido pelo C. elegans, verificou-se que a protease cisteínica Ced-3 é essencial para o desenvolvimento do processo. Assim, é provável que o processo apoptótico seja desencadeado por uma clivagem proteolítica de um ou mais substratos vitais, sendo que a capacidade do enzima Ced-3 em promover a morte celular pode ser bloqueada pelo producto codificado pelo gene ced-9 ou pelo gene homólogo humano bcl-2. (Vaux et al, 1996)

Interessantemente, verificou-se que em mutantes do C. elegans com cópias não funcionais do gene ced-3, ou seja, que possuem o processo apoptótico modificado, este facto não afecta o desenvolvimento nem o tempo de vida médio deste organismos.  Portanto, este resultado demonstra que neste organismo, o tempo médio de vida e os fenómenos de degeneração celular (envelhecimento) são regulados por processos genéticos que diferem daqueles que estão envolvidos no processo apoptótico. Deste modo, é possível que esta suposição seja também aplicável para os vertebrados. Consequentemente, o envelhecimento celular poderá representar um processo que evoluiu após o desenvolvimento de organismos multicelulares com células germinais separadas das células somáticas, enquanto os mecanismos de morte celular usados para funções de defesa do organismo ou para o seu desenvolvimento, ter-se-ão desenvolvido em organismos unicelulares. (Vaux et al, 1996) (Azevedo et al, 1999)

As Proteases cisteínicas

Inesperadamente, em 1993, a investigação de processos biológicos completamente dife­rentes da apoptose forneceu um conhecimento precioso para o estudo do processo da morte celular programada: foi descrito um gene humano, designado por Ice, significativamente semelhante ao gene ced-3 envolvido na exe­cução do processo apoptótico no C. elegans. Uma vez que aquele gene humano codifica uma protease, abriu-se o caminho para o estudo das suas propriedades enzi­máticas bem com de várias estratégias de identificação de enzimas semelhantes. Os esforços feitos resultaram na caracterização, recente, de uma família de proteases, denominadas por caspases, que são res­ponsáveis pelas alterações celulares pró­prias do processo apoptótico. (Azevedo et al, 1999)

 

Fig. 18- A família das caspases; (Apoptosis, 2001)

 

Está claramente estabelecido que as carac­terísticas morfológicas e bioquímicas próprias do processo apoptótico resultam da actividade proteolítica específica das proteases cisteínicas. Entre os vários substractos conhe­cidos desta actividade contam-se proteínas envolvidas na reparação do DNA, compo­nentes de complexos proteicos envolvidos na replicação do DNA, proteínas reguladoras da progressão do ciclo celular, elementos da maquinaria de splicing do RNA e, ainda. várias proteínas com funções estruturais como as lâminas e a actina. Torna-se óbvio que os alvos das caspases são elementos críticos para a viabilidade celular não sendo, portanto, de estranhar que os efeitos dos numerosos estí­mulos indutores de apoptose possam ser com­pletamente bloqueados por inibidores das caspases. (Azevedo et al, 1999) (Vaux et al, 1996)

Os membros da família das caspases par­tilham duas características essenciais: i) cli­vam proteínas a seguir a resíduos de ácido aspártico (Asp-X); ii) são sintetizadas na forma de proenzimas cuja activação resulta de uma proteólise relativamente limitada, com cliva­gem após resíduos de aspartato. Assim, a semelhança óbvia entre o mecanismo de acção e o meca­nismo de activação das caspases sugere um processo em "cascata" na trans­missão de sinais, ou seja, a activação de algumas caspases resulta na activação de outras cas­pases. (Vaux et al, 1996) (Azevedo et al, 1999)

Nos mamíferos, foram identificados seis homólogos diferentes da proteína Ced-3 (interleukin 1b converting enzyme, Nedd2, CPP32, ICErel II/TX/Ich-2, ICErel III, mch2), tendo sido demonstrado que a sobre-expressão destas proteínas poderá induzir o processo apoptótico e que este pode ser inibido através de certas interferências no mecanismo de acção destas proteases. Todos os genes que codificam estas proteases cisteínicas são inicialmente transcriptos em percursores polipeptídicos inactivos. Estes podem ser encontrados na maioria das células dos mamíferos (mas não em todas), mas de forma a adquirirem funcionalidade e, portanto promoverem a apoptose, devem ser submetidos a uma clivagem de certos resíduos de aspartato de maneira a poderem organizar-se em heterotetrâmeros. (Vaux et al, 1996)

A cisteína activa destas proteínas encontra-se no centro de um motivo QACRG altamente conservado, pois é comum a todas as proteases e uma mutação deste resíduo provocará uma inactivação deste tipo de enzimas. (Vaux et al, 1996)

Este tipo de proteases provenientes dos mamíferos, podem ser agrupadas em três grupos distintos (de acordo com a sua semelhança em relação à Ced-3 do nemátode):

-         CPP32 humana e Mch2;

-         Nedd2;

-         ICE, ICErel II/TX/Ich-2 e ICErel III (grupo com maiores níveis de similaridade entre si);

Todas estas proteases cisteínicas clivam/quebram os respectivos substratos depois dos resíduos de aspartato (pois existe uma determinada sequência de acontecimentos), mas a sua afinidade para os respectivos substratos também depende de outros resíduos. Portanto, estas moléculas demonstram possuir diferentes preferências para os diversos substratos bem como a susceptibilidade para sofrer inibição poderá ser diferente. Por outro lado, a especificidade para um dado substrato poderá ser originada se as proteases tetraméricas maduras possuírem a capacidade de serem formadas por subunidades de diferentes polipeptíeos (ex.: CPP32+Nedd2). (Vaux et al, 1996)

A necessidade de todas as proteases semelhantes à Ced-3 serem processadas nos resíduos de aspartato, bem como a sua capacidade de clivarem estes resíduos, sugere que algumas destas proteases possuem a capacidade de auto-clivarem-se ou agirem umas sobre as outras, de forma semelhante a uma cascata hierárquica. De facto, observou-se tanto in vitro como em sistemas celulares, algumas interacções entre as proteases cisteínicas. Assim, a forma funcional da ICE pode activar a pro-ICE bem como a pró-CPP32. (Vaux et al, 1996)

Para além de possuir a capacidade de activar a CPP32, a ICE também é conhecida por libertar uma substância bioactiva (interleucina-1b) a partir da pro-interleucina-1b, apesar desta substância não ser um regulador do sinal apoptótico. Em vez disso, é uma linfocina pró-inflamatória que comunica às células vizinhas, bem como às células do sistema imunitário, que o processo de apoptose se vai desenvolver. Assim, este sinal permite que as células do sistema imunitário se tornem funcionalmente activas e que se acumulem no local onde o processo apoptótico vai ser usado como um mecanismo de defesa anti-viral. Por outro lado, quando a apoptose é usada para fins de morfogénese ou homeostase (e assim, a resposta inflamatória seria indesejável), poder-se-á verificar a utilização de uma protease diferente da ICE. (Vaux et al, 1996)

Por outro lado, a protease CPP32 possui a capacidade de clivar e, portanto, inactiar o enzima poli(ADP-ribose) polimerase (PARP-1), cujo mecanismo de acção é utilizado para a reparação do DNA genómico. Assim, a clivagem da PARP poderá ser utilizada como um indicador de apoptose mas, em ratos “knock-out”, este processo desenvolve-se normalmente e, portanto, será provavelmente dispensável para o processo em causa. Por outro lado, a ICE não possui a capacidade de activar directamente a PARP, mas pode fazê-lo indirectamente através da activação da CPP32. (Vaux et al, 1996) (Azevedo et al, 1999)

Os estudos efectuados por Nicholsol et al., permitiram demonstrar que extractos citoplasmáticos de células apoptóticas possuem a capacidade de provocar, em núcleos isolados, certas alterações que promovem a morte celular bem como a capacidade de clivar a PARP. Além disso, remoção da protease CPP32 destes extractos preveniu que estes núcleos sofressem tais alterações. No entanto, esta actividade apoptótica foi totalmente restabelecida após adição de CPP32 purificada, apesar do mesmo não se verificar com a adição de ICE. Assim, apesar da CPP32 activa poder clivar a PARP, por si só não possui a capacidade de promover alterações apoptóticas nos núcleos isolados, sugerindo este facto que a CPP32 deverá actuar num substrato presente no extracto citoplasmático de forma a induzir a apoptose no núcleo. (Vaux et al, 1996) (Azevedo et al, 1999)

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Activação e Regulação das Proteases

O processo que desencadeia a cascata proteolítica das proteases cisteínicas não é totalmente conhecido. No modelo fornecido pelo nemátode C. elegans, a proteína Ced-4 é um elemento necessário para o desenvolvimento do processo de apoptose, sendo que poderá desenpenhar um papel a montante, em relação à função desenpenhada pela protease Ced-3. (Azevedo et al, 1999) (Vaux et al, 1996)

Apesar disso, é claro que todas as células dos mamíferos expressam várias proteínas relacionadas com o processo apoptótico, mesmo quando estas não vão sofrer este mecanismo. Assim, as proteases podem ser activadas sem ser necessário uma nova síntese e, portanto, a apoptose pode ser induzida sem influenciar a transcrição dos genes que codificam as proteases responsáveis pela apoptose. (Vaux et al, 1996)

Alguns estudos experimentais demonstraram que a sobre expressão da ICE, ICErel II/TX/Ich-2 e ICErel III e da Nedd2, provoca a morte celular da linha celular TH1, apesar destas possuírem níveis facilmente detectáveis de mRNA’s codificantes da ICE e da Nedd2, antes da “transfection”. No entanto, o facto deste procedimento induzir a morte celular permanece obscuro. Talvez esta sobre expressão promova a síntese de proteases numa concentração suficientemente elevada de forma a permitir uma activação auto-catalítica do percursor da protease. Alternativamente, o sinal intrínseco desta activação poderá existir em células que sejam inadequadas para activarem proteases suficientes para provocar a apoptose, mas o aumento dos níveis de percursores por “transfection”, poderá ser suficiente para promover o processo. (Azevedo et al, 1999)

Apesar da activação final destas proteases ser pós-transcricional, algumas vias que levam a esta activação podem envolver alguns passos que são controlados transcricionalmente. Por exemplo: a danificação do DNA provocada por irradiação, leva a um aumento dos níveis de p53, um factor transcricional que pode provocar a morte celular. Por outro lado, uma desregulação da expressão do c-myc, um factor transcricional oncogénico, também poderá provocar a apoptose em certas células. Assim, alguns sinais podem provocar o processo de morte celular na presença de ciclohexamida ou actinomicina, sendo que estes agentes estimulam a apoptose de muitas células. Por outro lado, em certas circunstâncias, o processo apoptótico induzido pela remoção de um factor de crescimento, pode ser bloqueado pela ciclohexamida (exemplo: quando o factor de crescimento é removido de culturas de neurónios primários ou células PC-12). Estes resultados sugerem que, nestas células, a remoção deste factor activa a transcrição dos genes responsáveis pelo processo de morte celular. Noutro tipo de células, tais como a linha celular hematopoiética FDC-P1 dependente da interleucina-3, a ciclohexamida não bloqueia a apoptose devido à remoção do factor de crescimento, mas, na realidade, estimula-o. Nesta situação os factores de crescimento podem manter os níveis de proteína que previnem a morte celular. Esta proteína não será a Bcl-2 ou uma semelhante pois numa cultura de células suplementada com um factor de crescimento, as células permanecem altamente susceptíveis para sofrer o mecanismo apoptótico através de várias cito-toxinas, enquanto as células que sobre expressam o gene bcl-2, encontram-se protegidas. O processo apoptótico induzido pela remoção do factor de crescimento, irradiação ou sobre-expressão do myc, pode ser altamente inibido pela Bcl-2. Estes resultados fornecem as evidências de que diferentes estímulos activam vias de sinal também diferentes mas que convergem para um único ponto: o mecanismo efector da morte celular. (Vaux et al, 1996)

A activação ou fase de sinal do processo de morte celular, engloba uma grande variedade de vias de tradução que originam vários sinais externos á célula bem como outros que se formam no interior da célula. Estes parecem incluir as cinases tirosínicas, os receptores “steroid”, entre outros estímulos. Por exemplo, quando a apoptose é induzida nas células T através da activação dos receptores antigénicos, o sinal é transmitido para a célula levando à sua activação e à expressão do gene c-myc. Consequentemente a célula regula a expressão do receptor CD95 (Fas/APO-1) bem como do respectivo ligando, na superfície da célula. Assim, estas moléculas podem actuar entre si (de uma forma autocrine ou paracrine), iniciando a via indutora da morte celular, sendo que, geralmente, a activação do receptor CD95 provoca a apoptose. (Vaux et al, 1996)

Nos timócitos de rato, nos quais o gene responsável pelo ICE foi mutado e onde as células foram sujeitas a um tratamento com inibidores específicos da ICE, verificou-se que estas não morrem, o que leva a supor que a ICE é essencial para a activação do processo de apoptose induzido pelo receptor Fas. Por outro lado, a ceramida também foi relacionada com a morte celular provocada pelos receptores Fas e TNFR-1, sendo que a própria ceramida também pode provocar a apoptose em vários tipos de células, mas, no entanto, o papel exacto da ceramida ainda não foi determinado. (Azevedo et al, 1999)

Várias proteínas que interactuam com os domínios citoplasmáticos dos receptores apoptóticos Fas (CCD95/Apo-1) e TNF (p55 TNF-R1 e p75 TNF-R2), foram recentemente relacionadas como sendo sinais intermediários do mecanismo apotótico. Algumas destas proteínas (MORT1/FADD, RIP e TRADD) possuem “domínios mortos” que estão dispostos nas proximidades dos receptores Fas e TNF-R1, sendo que a sobre-expressão destas proteínas induz o processo apoptótico. Provavelmente, estes domínios mortos facilitam as interacções proteína-proteína.

O processo apoptótico promovido pelos receptores Fas e TNF, ou pela sobre-expressão da proteína TRADD, é eficazmente inibido pela presença de CrmA (inibidor da ICE do vírus cowpox). No entanto, o ICE não é essencial para o desenvolvimento do processo apoptótico nem é essencial para a morte celular provocada pela radiação, corticosteróisdes, ou ausência do factor de crescimento, onde a apoptose é eficientemente antagonizada pela preseça da Bcl-2. Assim, parece que os diferentes estímulos que originam a apoptose podem activar proteases cisteínicas também diferantes. (Vaux et al, 1996)

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A família Bcl-2

O estudo molecular de uma anomalia cromossómica associada a uma doença ma­ligna humana permitiu, em 1986, a identificação de um gene notavelmente semelhante ao gene Ced-9 de C. elegans. Por outro lado, estudos posteriores deste gene humano, designado Bcl-2, confir­maram, cabalmente, que a proteína codificada era um potente inibidor do processo apoptótico. De facto, foram realizadas várias ex­periências em modelos muito diversos, quer quanto à natureza dos estímulos apoptóticos quer em relação ao tipo de células estudadas, quer ainda quanto a outras variações circunstanciais (resultantes da manipulação de componentes do meio extracelular ou, até, da manipulação de componentes intracelulares mediante o con­trolo da expressão de outros genes conhe­cidos). Deste modo, ficou progressivamente documentado que a proteína codificada pelo Bcl-2 partici­pa na regulação da apoptose desencadeada por um vasto leque de situações. (Vaux et al, 1996)

Estas descobertas validaram o carácter arquetípico dos conhecimentos obtidos em C. elegans e o Bcl-2 foi, temporariamente, o paradigma de um nível central de regulação da apoptose. Postulava-se, então, que vias de sinalização distintas convergiam para um eixo central, comum, no qual actuava a proteína codificada pelo Bcl-2, o homólogo humano do Ced-9 de C. elegans .

Consequentemente, o interesse pela investigação dos meca­nismos moleculares de regulação da apoptose alastrou-se rapidamente e o ritmo de acumulação de novos conhecimentos foi (e mantém-se) avassalador.

Assim, ao longo da última década foram iden­tificados vários genes humanos com semelhanças estruturais ao Bcl-2, todos eles en­volvidos no controlo molecular da apoptose e colectivamente designados por "família Bcl-2".

De facto, o primeiro gene, especificamente envolvido no processo de morte celular foi o bcl-2. Assim, a proteína Bcl-2 pode inibir a apoptose de muitas células, assemelhando-se ao inibidor Ced-9 proveniente do C.elegans, tanto funcionalmente como estruturalmente, sendo que nos mamíferos foram identificados 6 genes cuja sequência é similar ao gene bcl-2. Por outro lado, as proteínas Bax, Bak e Bad, possuem efeitos contrários em relação à função anti-apoptótica da proteína Bcl-2. Além disso, o gene bcl-x codifica duas proteínas: a maior, Bcl-XL, que inibe a apoptose, e uma mais pequena, a Bcl-XS que possui propriedades antagónicas em relação às proteínas e Bcl-2 Bcl-XL.

 Alguns membros da família das proteínas Bcl-2, partilham domínios conservados que permitem a formação de homo- e heterodímeros, sendo que a forma exacta de funcionamento destes complexos, bem como a forma funcional, não é totalmente conhecida.

Esta família, actualmente constituída por mais de catorze membros, está ainda em expansão e tem como referências organizadoras o gene bcl-2 e o seu contraponto bax. Assim, a proteína codificada pelo gene bax revelou-se capaz de, em algumas circunstâncias, potenciar ou acelerar os processos apoptóticos. No estudo destas proteínas foi também relevante a sua detecção isolada na forma de homodímeros (Bcl-2/BCL-2 ou BAX/BAX), ou como componentes de com­plexos heterodiméricos (Bcl-2/BAX).

Deste modo, é possível concluir que: 1) a família Bcl-2 engloba membros bloqueadores e mem­bros promotores do processo apoptótico; 2) as proteí­nas codificadas pelos genes da família Bcl-2 interactuam entre si através da constituição de homodímeros e de heterodímeros.

Entre os diferentes genes em questão, os mais detalhadamente estudados são os bloqueadores Bcl-2 e Bcl-XL e os promotores Bax, Bcl-XS, Bad e Bak. Uma particularidade interessante consiste no facto do Bcl-XL e do Bcl-XS serem, efectivamente, codificados por  mRNA’s de um só gene: o bcl-X. Este gene pode ser transcrito numa forma longa (Bcl-XL) cuja proteína bloqueia a apoptose, ou numa forma curta (Bcl-XS) cuja proteína pro­move a apoptose.

As proteínas que contêm uma região trans­membranar, do tipo Bcl-2, Bcl-XL e BAX, localizam-se nas membranas intracitoplas­máticas (membrana nuclear, retículo endoplas­mático rugoso e, particularmente, mitocôndrias), enquanto as proteínas sem região transmem­branar, como a BAD e a BID, existem no citosol. A diferente localização sub­celular dos membros da família Bcl-2 sugere, de imediato, mecanismos diferentes de parti­cipação na regulação da apoptose, independen­temente da qualidade de bloqueador ou pro­motor (note-se que os bloqueadores Bcl-2 e Bcl-XL e os promotores Bcl-XS e Bax têm região transmembranar).

Inúmeros estudos que utilizaram estra­tégias de controlo relativo da expressão dos genes da família Bcl-2, e que avaliaram as suas consequências em termos de susceptibilidade à apoptose, foram contribuindo para a elaboração progressiva de um modelo funcional. Simplificadamente, o modelo vigente pre­coniza que: i) a regulação central efectuada pelos membros da família Bcl-2 é mediada por formas homodiméricas e heterodiméricas de interacção entre as diferentes proteínas; ii) o estado de permissividade ou resistência ao pro­cesso apoptótico resulta de um balanço entre bloqueadores e promotores deste processo. Assim, o predomínio da expressão de bloqueadores como o Bcl-2 e o Bcl-XL (em homo ou hetero­dímeros) favorece a resistência à apoptose, enquanto o predomínio da expressão de promotores como o Bax (na forma de homodímeros) ou o Bad (na forma de heterodímeros) é permissivo à apoptose. Convém, uma vez mais, notar que não há uma regra funcional única que decorra do tipo de dimerização. (Azevedo et al, 1999)

Em circunstâncias biológicas, os níveis de expressão dos genes da família Bcl-2 são diferentes conforme o tipo de células, sendo que num determinado tipo celular, esses níveis podem variar em função da fase de maturação das células. Entre as variações de expressão conhe­cidas, as diferenças mais óbvias observam-se nos níveis de BCL-2 e na quantidade relativa de BCL-XL e BCL-XS. As diferenças dos níveis proteicos são paralelas às diferenças observadas na quantidade de mRNA o que estabelece a relevância de um nível de regulação transcri­cional na função normal da família Bcl-2. (Azevedo et al, 1999)

Por último, registe-se ainda que alguns membros da família Bcl-2 contêm regiões onde se localizam sequências ricas em serina, alvos potenciais de fosforilação. Dados recentes documentaram a fosforilação de BAD e de­monstraram que o estado de fosforilação desta proteína condiciona a sua heterodimerização: a fosforilação de BAD dissocia os heterodí­meros BCL-2/BAD promotores de apoptose e, consequentemente, disponibiliza BCL-2 para dimerizações bloqueadoras. As consequências funcionais da fosforilação de BAD favorecem a noção de que modificações pós-translacionais de alguns membros da famí­lia Bcl-2 podem constituir um nível adicional de regulação da apoptose. (Azevedo et al, 1999)

Em resumo, a família Bcl-2 e o modelo funcional elaborado alicerçam o paradigma da regulação central da "morte celular programada": o processo apoptótico é regulado por um núcleo ou eixo central regulatório para o qual con­vergem diferentes estímulos. Este núcleo ou eixo é constituído por promotores e bloquea­dores da apoptose que interactuam entre si (família Bcl-2), de cujo balanço resulta um estado de permissividade ou de resistência à morte celular. Este paradigma é frequente­mente referido como "death/life checkpoint".

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As Mitocôndrias e o Processo Apoptótico

Durante a última década foram efectuados numerosos estudos bioquímicos em sistemas especialmente formulados para permitir isolar componentes essenciais do processo apoptótico. São exemplos destes estudos a indução deste processo em condições de bloqueio da síntese pro­teica e a sua indução em condições de controlo do ciclo celular, assim como o estudo da importância relativa do núcleo e do cito­plasma durante o processo apoptótico (pela utilização de núcleos isolados na presença ou ausência de diferentes extractos citoplas­máticos ou pela utilização de citoplastos - células anucleadas - com ou sem extractos nucleares). Dos progressos feitos neste domínio bioquímico salientam-se as seguintes demonstrações:

1)      o processo apoptótico pode ocorrer na ausência de síntese proteica;

2)      a apoptose pode ser induzida em qual­quer fase do ciclo celular;

3)      podem ocorrer alterações apoptóticas em citoplastos;

4)      a indução de alterações apoptóticas em núcleos isolados requer a presença de mitocôndrias ou de extractos mitocon­driais.

 

Deste conjunto de resultados enunciados pode-se concluir que a resposta a alguns estí­mulos apoptóticos pode ser independente da regulação transcricional de genes bloqueadores, promotores ou executores da apoptose e que, em condições normais, as células contêm os instrumentos necessários para a execução apoptótica (é sabido que esses instrumentos são as procaspases). Por outro lado, os resultados expostos evidenciam que os mitocôndrios são componentes essenciais da apoptose. (Azevedo et al, 1999)

Nas fases iniciais dos processos apoptóticos observa-se uma perda do potencial de membrana mitocondrial (DYm), geralmente associada à formação de poros que modificam as condições de selectividade das trocas entre os mitocôn­drios e o citosol (poros de transição de permea­bilidade). Durante um tempo considerável o significado real das alterações, mitocôndriais foi discutível. Algumas interpretações admi­tiam que essas alterações protagonizavam a participação mitocondrial no processo apop­tótico, constituindo o mecanismo de libertação de factores mitocondriais mediadores de apop­tose (AIF's: apoptosis inducing factors). A in­terpretação alternativa de que as alterações mito­condriais representavam um efeito do processo apoptótico era também aceitável. (Azevedo et al, 1999)

Vários estudos efectuados participaram na identi­ficação de um dos componentes mitocondriais - o citocromo c – libertado para o citosol, nas fases iniciais do processo apoptótico. No entanto, o citocromo c libertado pelos mi­tocôndrios requer a presença de outros facto­res citosólicos para a propagação do estímulo apoptótico. Alguns destes componentes cito­sólicos foram, também recentemente, caracte­rizados e parecem funcionar num complexo que associa o citocromo c, um "factor cito­sólico associado à apoptose" (Apaf-I) e a procaspase-9; postula-se que a formação deste complexo na presença de ATP resulta na activação da caspase-9 e, subsequentemente, de uma cascata de caspases (Fig.19)

 

Fig. 19- A participação mitocôndrial no processo apoptótico. Em condições de permissividade ao estímulo apoptótico ocorre a libertação do citocromo c, que participa num complexo activador das caspases. A formação de poros de transição, na sequência do estímulo apoptótico, origina a libertação de factores mitocondriais indutores de apoptose (AIF’s); (Azevedo et al, 1999)

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É importante notar que existem algumas evidências da libertação de outros factores mitocondriais indutores de apoptose (AIF's), não totalmente caracterizados mas, aparentemente, com actividade proteolítica "próxima" das caspases .

Como já foi referido, durante os estudos iniciais sobre o gene Bcl-2 ficou demonstrada a localização selectiva da proteína bloqueadora da apoptose nas membranas intracitoplas­máticas, com particular relevo para as mem­branas mitocondriais. Acresce ainda que pro­teínas Bcl-2 sem domínio transmembranar, obtidas por manipulação genética, se revelaram incapazes de manter a localização mitocon­drial, e a sua função bloqueadora de apoptose é significativamente inferior à da proteína normal. Estudos recentes sobre outros mem­bros da família Bcl-2 reforçaram a relevância funcional da relação entre estas proteínas e os mitocôndrios. Por exemplo, num sistema experimental, foi demonstrado que a molécula de Bcl-XL participa na constituição de "poros" mitocon­driais, com permeabilidade selectiva e variável em diferentes circunstâncias. Também já se fez referência à possibilidade de bloquear (par­cialmente) o sinal apoptótico desencadeado pela activação do receptor Fas/CD 95 quando este é (par­cialmente) transmitido através da participação mitocondrial. (Azevedo et al, 1999)

Finalmente, foi recentemente demonstrada a relação entre o efeito bloqueador da apop­tose, do Bcl-2 e do Bcl-XL, e a ausência de libertação mitocondrial do citocromo c. Por outras palavras, sabe-se que o efeito bloquea­dor da apoptose dos membros da família Bcl-2 resulta directamente do bloqueio da libertação de citocromo c mitocondrial; admite-se que o efeito daqueles bloqueadores na perda do potencial de membrana mitocondrial possa ser .directo ou indirecto. Com efeito, a libertação de AIF's mitocondriais resulta directamente da formação dos poros de transição de permeabili­dade e só é parcialmente regulada pela família Bcl-2. (Azevedo et al, 1999)

Dos dados resumidamente expostos pode-se concluir que os mitocôndrios, através da libertação de citocromo c, constituem o elo entre a família Bcl-2 e a activação das caspases. Adicionalmente, e por vezes isolada­mente, a perda do potencial de membrana mitocondrial, com formação de poros de transição de permeabilidade e libertação de AIF's, desencadeia a activação de caspases. Destes factos deduz-se também que a par­ticipação mitocondrial no processo apoptótico representa o elemento inicial da execução apoptótica.

O receptor TNF-R1: uma perspectiva geral

O TNF (Tumor Necrosis Factor) é um dos principais mediadores do fenómeno de apoptose, bem como de processos bastante importantes tais como respostas inflamatórias e  imunitárias.

A interacção entre o TNF e o respectivo receptor (TNF-R1), activa várias vias de comunicação celular, sendo que estas possuem a semelhança de que cada via induzida pelo TNF envolve a formação de um complexo multiproteico na membrana celular. Assim, dada a importância dos processos onde este factor está envolvido, ao longo das últimas décadas tem-se descoberto alguns componentes bem como os respectivos mecanismos envolvidos nesta via apoptótica. (Scaffidi et al.,1998)

A actividade anti-neoplásica, agora conhecida por TNF, foi descrita pela primeira vez acerca de um sécula atrás. No entanto, foi necesswário esperar até 1984 até que o TNF humano fosse purificado e o seu cDNA clonado, sendo então possível catalogar “TNF’s pleiotropic activities”. Para além de estar envolvido no processo apoptótico de certas céulas tumorais, o TNF é responsável pela regulação de processos inflamatórios bem como da resposta imunitária. No entanto, uma produção inadequada do factor TNF está relacionada com várias patologoias humanas, incluindo-se neste grupo a “sepsis”, diabetes, neoplasias, osteoporose, rejecção “allograft” e várias doenças autoimunitárias tais como a esclerose múltipla, atrite reumatóide e certas infecções ósseas. (Chen et al, 2002) (Scaffidi et al.,1998) (Chen et al, 2002)

Apesar do mecanismo envolvido nestes processos não ser totalmente conhecido, nos últimos 12 anos os detalhes moleculares do sinal originado pelo TNF têm sido gradualmente compreendidos. Assim, hoje em dia, o conhecimento dos fenómenos em cascada originados pelo TNF, fornecem um modelo bastante viável para elucidar todas as restantes vias utilizadas por outras proteínas semelhantes ao TNF. Por outro lado, estes conhecimentos também permitiram o desenvolvimento de novas terapias cujo objectivo é neutralizar os efeitos nefastos provocados pelas patologias associadas ao factor TNF. (Chen et al, 2002)

O TNF é constituído por três subunidades iguais (ou seja é um homotrímero) com 157 resíduos amínicos cada uma, sendo produzido principalmente por macrófagos activos. Quanto aos seus receptores membranares específicos, estes são denominados por TNF-R1 e TNF-R2, sendo que ao longo dos tempos inúmeras abordagens experimentais revelaram que o TNF-R1 é o responsável pela maioria da actividade biológica relacionada com o TNF. Assim, a ligação do TNF ao TNF-R1, provoca uma série de eventos intracelulares cujo resultado final implica a activação de dois factores de transcrição: o factor nuclear kB (NF-kB) e o c-Jun. (Chen et al, 2002) (Scaffidi et al.,1998)

Estes factores transcricionais são responsáveis pela indução da expressão de alguns genes bastante importantes pois estes encontram-se envolvidos em vários processos biológicos, incluindo o crescimento/desenvolvimento, a morte celular, a oncogénese bem como as respostas inflamatória e imunitária. Deste modo, o passo inicial do mecanismo de acção do TNF envolve a ligação da sua forma trimérica ao domínio extracelular do receptor TNF-R1, bem como a segreção da proteína inibidora SOOD (Silencer of Death Domains), a partir do domínio intracelular (ICD) deste mesmo receptor. O agregado resultante (TNF-R1 ICD) é reconhecido por uma “adaptor protein TNF receptor-associated death domain”, vulgarmente conhecida por TRADD. Consequentemente, esta proteína recruta proteínas adaptadoras adicionais, proteínas de interacção com receptores (RIP), factor 2 associado ao TNF-R (TRAF2) bem como o domínio de morte associado ao Fas (FADD). Deste modo, as proteínas acima referidas, “recruits” algumas proteínas importantes para o receptor TNF-R1, sendo estas responsáveis pelo início do processo de activação desta via apoptótica. (Chen et al, 2002)

 

Fig.20 - Via de transdução do sinal promovido pelo TNF: a ligação do TNF ao respectivo receptor TNF-R1, provoca a libertação do SODD bem como a formação de um complexo constituído por proteínas “adaptor” bastante importantes, tais como: TRADD, TRAF2, RIP e FADD. Por sua vez, estas proteínas “recruit” algumas enzimas específicas (por exemplo, caspase-8 e IKKb) para a via mediada pelo complexo TNF-R1, que as activa e inicia os eventos “downstream” que promovem a apoptose bem como a activação do factor transcricional NF-kB e do JNK. (Chen et al, 2002)

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Por exemplo, a caspase-8 é atraída pela FADD para o complexo TNF-R1 (onde sofre activação, presumivelmente por auto-clivagem), dando origem a uma cascada de reações catalisadas por diversas proteases cujo mecanismo de acção provoca o processo apoptótico. Por outro lado, a TRAF-2, interactua com certas proteínas celulares inibitórias do processo apoptótico (cIAP-1 e cIAP-2: Inhibitory Apoptosis Protein-1 e 2), que também possuem a actividade ligase da proteína ubiquitina. Além disso, pensa-se que a TRAF-2 também é responsável por activar certos enzimas da família das MAPKKK (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase), como por exemplo a MEKK1 (extracelular signal-regulated kinase kinase kinase1) ou a ASK-1 (Apoptosis-stimulated kinase1), num complexo localizado perto do receptor. Consequentemente, são activadas uma série de reacções em cascada, providas pelas caspases, cuja finalidade é a activação da JNK (c-Jun NH2-terminal kinase): uma cinase que fosforila o c-Jun, aumentando a sua actividade transcricional. Finalmente, a cinase RIP desenpenha um papel fundamental na terceira fase do sinal em cascada promovido pelo TNF: a activação do factor transcricional NF-kB. No entanto, a actividade enzimática do RIP não é essencial para a activação do NF-kB induzida pelo TNF pois, esta é baseada numa fosforilação e na degradação das proteínas inibitórias deste factor (IkB), que vulgarmente retêm o NF-kB no citoplasma de células não estimuladas. (Chen et al, 2002)

Os últimos cinco anos, testemunharam grandes avanços no conhecimento dos mecanismos relacionados com a via promovida pelo TNF. Especialmente importante, encontra-se a identificação de um complexo multiproteico denominado por cinase IkB (IKK), que regula a fosforilação das proteínas initórias do factor NF-kB (IkB) de uma forma dependente do TNF. Deste modo, verificou-se que o núcleo do complexo IKK, é constituído por duas subunidades catalíticas IKKa e IKKb e, uma subunidade regulatória (NEMO ou IKKg), que é um regulador essencial do IKKb. Além disso, o complexo IKK contém um chaperone específico para a cinase, constituído por Cdc37 e Hsp90, que desenpenha um papel fundamental no transporte deste complexo do citoplasma para a membrana. Por sua vez, o complexo IKK também é atraída para o receptor TNF-R1, onde sofre activação. Uma vez que este processo depende da acção do RIP, este facto indica que a activação do IKK no complexo receptor também ocorre através de um factor intermediário dependente do RIP, provavelmente uma cinase. (Chen et al, 2002)

Alguns estudos efectuados em ratos gene knock-out, permitiram estabelecer o papel essencial desempenhado pela IKKb na activação do NF-kB induzida pelo TNF, bem como a acção regulatória que o NEMO exerce na activação do complexo IKK, como resposta a vários sinais. Por outro lado, a IKKa desempenha apenas um papel minoritário na activação do NF-kB induzida pelo TNF, apesar de também possuir outras funções importantes, tais como funcionar como cinase NF-kB2/p100 nas células B. (Chen et al, 2002)

Outra característica interessante destes processos é a existência de bastantes semelhanças entre a via apoptótica e os mecanismos que envolvem a acção do NF-kB e a JNK. Deste modo, na ausência de actividade do NF-kB, a susceptibilidade para o TNF induzir o processo apoptótico aumenta, enquanto a hiperactivação deste mesmo factor inibe os fenómenos de morte celular programada. De uma forma semelhante, a activação do JNK induzida pelo TNF extende-se por um intervalo de tempo superior em relação a células que não possuam NF-kB,sendo que os produtos codificados por vários genes activados por este factor inibem a activação da JNK promovida pelo TNF. Por outro lado, a activação do NF-kB promove uma nova síntese de IkB, bem como de outras moléculas inibitórias, tais como as cIAP’s e, assim, estamos perante um novo processo de regulação da duração e da intensidade do sinal provocado pelo TNF.

Até à data, a maioria dos componentes da via apoptótica promovida pelo TNF foram confirmados tanto ao nível bioquímico como genético, fornecendo assim uma grande quantidade de potenciais alvos para o desenvolvimento de uma nova geração de agentes anti-inflamatórios. No entanto, muitas questões permanecem ainda por desvendar. Por exemplo, qual será o elemento da família das MAPKKK responsável pela iniciação das reacções em cascata das cinases que, posteriormente, activam a JNK? E como será que está cinase é “recruited” para o complexo formado pelo TNF-R1 e activada em resposta ao estímulo promovido pelo TNF? Por outro lado, o descobrimento dos detalhes moleculares do mecanismo de activação de enzimas como a caspase-8, bem como do complexo IKK no receptor TNF-R1, será uma chave importante para o completo conhecimento da natureza dinâmica do sinal promovido pelo TNF. Finalmente, a base molecular para a relação entre a apoptose, o NF-kB e as vias que envolvem a JNK, não é totalmente compreendida. Deste modo, decifrar estes puzzles poderá ajudar na interpretação da forma como o sinal específico produzido pelo TNF está envolvido em diversos contextos biológicos. (Chen et al, 2002)

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O paradigma da via apoptótica induzida pelo receptor Fas

A apoptose e todas as formas relacionadas de morte celular possuem uma importância central para o desenvolvimento da homeostase, desenvolvimento de neoplasias bem como na regulação do sistema imunitário. Assim, e como já foi referido, o processo apoptótico é iniciado por duas vias principais: uma via intrínseca, que emerge do mitocôndrio e, uma via extrínseca que é induzida pela activação de certos receptores apoptóticos. (Chen et al., 2002)

O Fas (também denominado por Apo-1 ou CD95) é um membro da super família dos receptores TNF (TNFR), sendo que desempenha um papel importante na regulação fisiológica do processo apoptótico, estando relacionado com diversas patologias do sistema imunitário. Apesar do complexo formado por este receptor e o respectivo ligando (FasL), este sistema tem sido principalmente relacionado com funções apoptóticas, apesar de também emitir alguns sinais activadores e proliferadores através de certas vias cujo conhecimento é escasso. (Chen et al., 2002)

Na ausência do FasL,  os complexos inactivos do receptor Fas são formados pela ligação de certos domínios do pré-ligando. Deste modo, a interacção do receptor com a molécula FasL (ou anticorpos agonistas), permite a formação e a reorganização destes complexos numa estrutura designada por DISC (Death-inducing signaling complexes). Assim, os complexos Fas-DISC, são formados pela proteína “adaptor” FADD bem como pelas proteases cisteínicas caspase-8 e –10, que possuem a capacidade de iniciar o processo apoptótico. Será ainda importante referir que os complexos DISC resultam do processamento auto-proteolítico das caspases acima referidas, bem como da libertação destas proteases no seu estado activo.

 

Fig. 21- O processo apoptótico induzido pelo FasL ocorre devido ao processamento auto-proteolítico da caspase-8; (Wajant, 2002) (http://stke.sciencemag.org/cgi/cm/CMP_7107)

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Nas células do tipo I, a caspase-8 processada (ou activa), é suficiente para promover directamente a activação dos outros membros da família das caspases, cuja acção sobre substratos bem definidos, promove a execução da via apoptótica. Por outro lado, nas células do tipo II, uma activação adequada do efector das caspases, pelo Fas, depende de um ciclo de amplificação que se baseia na clivagem da proteína Bid (membro da família pro-apoptótica Bcl-2), numa reacção catalisada pela caspase-8. Consequente, verifica-se a libertação de certos factores mitocôndriais pró-apoptóticos (como por exemplo o citocromo c bem como o efector mitocôndrial das caspases, SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases- também denominado por Diablo), de forma a induzir a formação de um complexo com a caspase-9, denominado por aptosoma. Assim, a caspase-9 activa a caspase-3, que por sua vez, actua sobre a caspase-8 no lado exterior do complexo Fas-DISC, completando desta forma um ciclo positivo. (Wajant, 2002)

Cada etapa do processo apoptótico mediado pelo receptor Fas, pode ser alvo de um mecanismo regulatório, estimulando as células a exibir respostas flexíveis perante um estímulo provocado por este receptor. De acordo com a hierarquia dos eventos apoptóticos promovidos pelo Fas, estes mecanismos regulatórios podem ser específicos para o Fas ou comuns para outros agentes pro-apoptóticos, sendo que poderão afectar o mecanismo de morte celular programada. Na maioria das células, o gene responsável pela codificação do FasL, está transcricionalmente inactivo e, portanto, o FasL efectua uma regulação da sua própria expressão. Assim, como exemplo, através da transcrição do NF-kB, da proteína activadora 1 (AP1) ou do factor nuclear das células T activadas (NF-AT), é possível a regulação dos efeitos induzidos pelo complexo Fas/FasL, de uma forma semelhante ao que se verifica na activação da morte celular das células T CD4+. Por outro lado, de uma forma menos extensiva, a regulação da expressão do receptor Fas também é utilizada para controlar a resposta induzida por este receptor (como por exemplo na apoptose induzida pelo p53). (Wajant, 2002)

O efeito provocado pela ligação do ligando FasL ao respectivo receptor, pode sera antagonizado pelo receptor DcR3, por várias isoformas do Fas (com ausência dos domínios transmembranares e/ou death domains), bem como pela formação de FasL solúvel, devido a um processamento proteolítico ou splicing alternativo. (Wajant, 2002)

A capacidade do complexo Fas-DISC em activar a caspase-8, é principalmente regulada pela “FADD-like interleukin-1b converting enzyme”(FLICE), bem como pela proteína inibitória FLIP. Esta proteína existe em várias isoformas que são estruturalmente semelhantes à caspase-8, sendo que não possuem actividade enzimática. Desta forma, a FLIP poderá ser incorporada nos receptores apoptóticos DISC e, consequentemente, inactiva o processo mediado pelo DISC através da libertação da caspase-8 na sua forma funcional. Além disso, a apoptose mediada pelo Fas, é controlada por um grupo de reguladores da via mitocôndrial de  apoptose (como por exemplo: membros da família Bcl-2, SMAC ou  certas proteínas anti-apoptóticas). Por outro lado, a morte celular promovida pelo receptor Fas, não ocorre exclusivamente através dos mecanismos apoptóticos, sendo que de acordo com o contexto celular, também poderá ocorrer por necrose. Assim, o processo de necrose induzido pelo Fas, requer a presença da proteína adaptadora FADD bem como a RIP (Fas-interacting serine/threonine kinase receptor interactind protein). No entanto, as bases moleculares que relacionam os mecanismos promovidos pelo Fas, FADD e RIP na execução do processo necrótico, como por exemplo, a produção de ROS, ainda não são totalmente conhecidas. (Wajant, 2002)

Apesar do receptor Fas ser conhecido predominantemente como um efector apoptótico, sabe-se hoje em dia que também possui a capacidade de reconhecer e traduzir sinais proliferativos nas células T (apesar deste facto estar parcialmente relacionado com a via apoptótica). De facto, a estimulação do crescimento das células T pelo ligando FasL pode ser bloqueado por inibidores das caspases. Além disso, a caspase-8, FADD e a FLIP estão implicadas na expressão, induzida pelo Fas, do “proto-oncogene” c-fos, sendo que alguns trabalhos experimentais demonstram que ratos com uma deficiência destas moléculas possuem uma proliferação deficiente das células T. No entanto, o grau de extensão com que esta proliferação está relacionada com a activação do NF-kB, permanece por clarificar. Deste modo, o papel da activação da JNK, numa proliferação das células T mediada pelo Faz, parece ser pouco provável pois, normalmente, a FADD não intervem na activação da JNK. Em vez disso, o Fas promove a activação da JNK através da interação com a proteína DAXX e a ASK-1 (sinal apoptótico regulado pela cinase 1: membro da família MAPKKK). Apesar da activação da JNK ser vulgarmente relacionada com o sinal apoptótico mediado pelo Fas, geralmente o efeito pró-apoptótico deste processo não contribui directamente para a morte celular induzida por este receptor.

Assim, desde a clonagem do Fas em 1991, efectuaram-se tremendos progressos no conhecimento sobre a base molecular da apoptose induzida por este receptor. Apesar disto, Existem ainda muitas questões relacionadas com o Faz que permanecem por desvendar e compreender, principalmente no que diz respeito às suas funções não-apoptóticas. Assim, e por agora, é fácil verificar que o sistema Faz-FasL irá permanecer como um paradigma dos receptores apoptóticos. (Wajant, 2002)

PARP-1: um perpetuador do processo apoptótico?

Acerca de 2 biliões de anos atrás, as células anaeróbias evoluíram para eucariotas, em grande parte devido à incorporação no seu citoplasma de uma forma ancestral do mitocôndrio. Apesar do sucesso desta associação simbiótica, ao longo de todo o processo evolutivo, os mitocôndrios mantiveram uma série de moléculas que promovem um processo altamente regulado e coordenado, denominado por apoptose. Assim, foram provavelmente estas moléculas as principais responsáveis pela sobrevivência da forma anestral do mitocôndrio: o protomitocôndrio. Deste modo, o conhecimento destas moléculas (responsáveis pela apoptose) bem como o seu mecanismo de acção, incluindo os processos de activação e regulação, constituem um desafio para os investigadores e poderá promover a descoberta de novas abordagens terapêuticas para muitas patologias humanas. (Chiarugi et al, 2002; Badley et al, 2000)

Recentemente, Yu et al. (2002) descobriu que a libertação de uma citotoxina mitocôndrial promove o processo apoptótico através da activação do enzima nuclear poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1). Este enzima é altamente expresso no núcleo, pois verifica-se a presença de uma molécula por cada 1000bp. Assim, a PARP-1 catalisa a transformação do NAD+ em nicotinamida e poli(ADP-ribose), sendo que em condições homeostáticas este enzima participa em acções de reparação e replicação do DNA bem como na regulação destes processos. Além disto, em resposta a factores de stress oxidativo que são tóxicos para para o genoma, a actividade catalítica do PARP-1 aumenta substancialmente, num mecanismo que parece ser crucial para a manutenção da integridade genómica (Yu et al, 2002; Chiarugi et al, 2002). No entanto, uma hiperactivação deste enzima poderá esgotar as reservas celulares de NAD+ e ATP, sendo consequência final deste facto uma ruptura energética na célula com a consequente morte. Assim, a descoberta de que o processo de morte celular pode ser inibido através dos efectores negativos da PARP-1, ou pela remoção do respectivo gene, promoveu um aumento no interesse sobre os processos em que este enzima está envolvido (Chiarugi et al, 2002). Tal facto é particularmente devido à descoberta que a inibição da PARP-1 poderia ter efeitos terapêuticos, uma vez que este enzima está envolvido no processo de morte celular em relação a diversas patologias tais como a isquemia cerebral, infarte do miocárdio, doenças inflamatórias, diabetes e ”septic shock” em vários modelos fornecidos por certos animais (Yu et al, 2002; Chiarugi et al, 2002). O facto de a PARP-1 estar directamente envolvida no processo de apoptose é evidenciado pela observação de um aumento da expressão de poli(ADP-ribose) durante a fase inicial do mecanismo apoptótico bem como um aumento da sobrevivência  celular após delecção do gene parp-1. (Chiarugi et al, 2002)

A família de proteases cisteínicas, vulgarmente denominadas por caspases, são activadas depois da libertação do citocromo c dos mitocôndrios, num processo dependente da presença de ATP. No entanto, e apesar da activação destes enzimas por uma via independente da libertação deste transportador electrónico estar bem documentada, as condições sobre as quais a quantidade de ATP celular diminui drasticamente, não favorecem a via apoptótica dependente das caspases. Assim, baixos níveis de ATP promovem a morte celular através da necrose, num processo no qual se verifica a indução da falha dos transportadores iónicos bem como pela ruptura da membrana plasmática. (Chiarugi et al, 2002)

Deste modo, como é que o processo apoptótico poderá estar relacionado com a hiperactivação da PARP-1, com a diminuição dos níveis de NAD+ e a consequente falta de energia metabólica?

O estudo recentemente efectuado por Yu e os seus colegas, forneceu a evidência de que a actividade catalítica da PARP-1 origina a libertação de uma proteína mitocôndrial pró-apoptótica denominada por factor indutório de apoptose (AIF), cujo mecanismo de acção promove uma via apoptótica independente da família das caspases.

 

Fig. 22 — O sinal apoptótico mediado pela PARP-1;  (Chiarugi et al, 2002)

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A AIF é uma flavoproteína existente no espaço intermembranar (tal como o citocromo c e outros reguladores apoptóticos), sendo considerada um dos efectores mais poderosos do processo apoptótico, apesar do seu mecanismo de acção não ser totalmente conhecido. Uma vez segregada do mitocôndrio, o AIF rapidamente atinge o núcleo onde provoca a condensação da cromatina bem como o transporte da fosfatidilserina para o lado exterior da membrana plasmática (sendo este fenómeno característico do processo apoptótico). Posteriormente à sua segregação a partir do mitocôndrio, o AIF também provoca a libertação do citocromo c bem como a activação da família das caspases (apesar do bloqueio das reacções em cascada efectuadas pela família das caspases não abolir o processo apoptótico induzido pelo AIF em modelos experimentais). (Chiarugi et al, 2002)

Assim, o estudo efectuado por Yu et al., demonstra que o mecanismo de morte celular dependente da PARP-1 e, mediado pelo AIF, é caracterizado pela produção de poli(ADP-ribose) e pela diminuição dos níveis de NAD+. Por outro lado, estes autores conseguiram bloquear o processo apoptótico através da microinjecção de anticorpos específicos para o AIF, apesar de não se verificar o mesmo com a utilização de efectores negativos das caspases (no entanto, verificou-se a presença de indicadores relacionados com a apoptose mediada pelas caspases: libertação do citocromo c, activação das caspases e a clivagem da PARP-1). (Chiarugi et al, 2002)

Notavelmente, a sobre expressão da proteína Bcl-2 (um dos agentes anti-apoptóticos mais poderosos), retardou, mas não inibiu, o processo de apoptose. Deste modo, foi possível demonstrar o porquê do bloqueio da apoptose ser incompleto após a inibição ou a deleção dos genes codificantes das caspases, em alguns modelos in vitro e in vivo.

Ainda no estudo efectuado por Yu et al., este observou que num intervalo de tempo de cerca de 5 minutos após os danos celulares e a libertação do AIF, um sinal promovido pela PARP-1. Deste modo, a diminuição dos níveis intracelulares de NAD+ parece estar englobado nesta via, apesar desta ideia necessitar de confirmação. É ainda importante referir que o mitocôndrio contêm a maioria das reservas celulares de NAD+, apesar da activação da PARP-1 participar na diminuição dos níveis deste composto. (Yu et al, 2002)

Assim sendo, põe-se uma questão:

 

Como é que a activação da PARP-1 modifica os mecanismos de armazenamento do NAD+?

 

Existem vários mecanismos que podem contribuir para esta modificação, como por exemplo, a actividade da NADase mitocôndrial ou uma mudança na compartimentação do NAD+ (provavelmente através da modificação da permeabilidade dos poros mitocôndriais), sendo que estes eventos podem favorecer a acessibilidade do PARP-1 para o NAD+. No entanto, estes mecanismos necessitam de ser clarificados, ou seja, será necessário compreender as flutuações dos níveis de NAD+  como mecanismo de resposta às mudanças de compartimentação celular bem como o papel desenpenhado pelo NAD+ na comunicação celular. Por outro lado, as descobertas efectuadas por Yu et al. poderão originar muitas outras linhas de investigação. Por exemplo, qual será a característica do mecanismo de activação da PARP-1 que permite o papel duplo que esta desenpenha na apoptose e na necrose? Será bidirecional o sinal entre o núcleo e o mitocôndrio após a libertação de moléculas de poli(ADP-ribose)? E como é que a neutralização da actividade do AIF previne que as células com baixos limites de NAD+ sofram apoptose, pelo menos durante um intervalo de 24h? Será que esta informação poderá ser utilizada para fins terapêuticos? E, quais serão os mediadores “downstrean” do AIF? Porventura, o AIF estimulará uma via específica que permite criar resistência contra os inibidores das caspases?

As respostas a estas questões poderão, não apenas clarificar uma eventual ligação entre a apoptose e a PARP-1 mas também elucidar o “compromisso negociado” entre os mitocôndrios ancestrais e as células eucariótas, acerca de 2 biliões de anos atrás.     

Assim, de forma a esclarecer o mecanismo apoptótico que envolve o enzima PARP-1, fibroblastos embriónicos imortalizados foram expostos a determinadas quantidades de MNNG (0,5 mM), sendo este um agente que potencialmente poderá activar a PARP-1 bem como os respectivos efeitos citotóxicos. Assim, após um intervalo de 12 a 24h,  verificou-se a morte celular dos fibroblastos WT (Wild-type), enquanto que os fibroblastos PARP1-KO (ou seja, aqueles que não expressavam o enzima em causa), demosntraram ser resistentes aos efeitos tóxicos do MNNG (Fig. 36A) Por outro lado, estes autores (Yu et al, 2002), também confirmaram que a activação da PARP-1 provoca a diminuição dos níveis celulares de NAD+ pois, após 15 minutos verificou-se uma redução de 80% e após 30 minutos os níveis deixaram de ser detectáveis. Por outro lado, os níveis de NAD+ nos fibroblastos PARP1-KO permaneceu a cerca de 60%, durante 24h, em relação ao controlo (Fig. 23b).

Para averiguar a interligação entre o mecanismo apoptótico induzido pelas caspases e o que envolve a PARP-1, Yu et al. investigaram o efeito provocado por alguns inibidores das caspases (boc-as-partyl-fmk e Z-VAD.fmk). Assim, observaram que estes inibidores não possuem a capacidade de bloquear a toxicidade induzida pelo MNNG (Fig. 23c), apesar de inibir eficazmente a activação das caspases. Por outro lado, alguns inibidores específicos da PARP-1, como por exemplo, 1,5-dihidroxi-isoquinolina (DHIQ) e 3,4-dihidro-5-[4-(1-piperidinil)butoxi]-1(2H)-isoquinolinona (DPQ), bloquearam completamente a toxicidade induzida pelo MNNG (Fig. 23c). Assim, todos estes dados, sugerem que o processo de morte celular promovido pelo estímulo provocado pelo MNNG é dependente da acção da PARP-1 e independente das caspases.

Além disto, a utilização da técnica de microscopia confocal permitiu confirmar a translocação do AIF para o núcleo dos fibroblastos “wild-type”, apesar do mesmo não se verificar para os fibroblastos PARP1-KO, depois do tratamento com MNNG (Fig. 23, D). Por outro lado, a inibição da PARP nos fibroblastos “wild-type”, através da presença de DPQ, promoveu a translocação do AIF bem como a condensação nuclear, após tratamento com MNNG (Fig.23 D). Portanto, estas observações implicam a activação da PARP-1 no desencadeamento da translocação do AIF.

 

Fig. 23- A morte celular dos fibroblastos induzida pelo MNNG, é dependente da PARP-1 e independente da via das caspases. (A)- Efeito do MNNG nos fibroblastos (citometria de fluxo); (B)- Efeito do MNNG nos níveis celulares de NAD+; (C)- Efeito do MNNG no processo apoptótico, na presença de inibidores das caspases bem como da PARP-1; (D)- A translocação do AIF em fibroblastos tratados com MNNG é dependente do PARP-1. A redistribuição do AIF no núcleo é demonstrada pelo overlap do AIF e pela coloração cor-de-rosa do núcleo.

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Assim, baseados nestas observações, estes autores propõem que a activação da PARP-1 induzida por alguns processo de  danificação do DNA, origina uma diminuição dos níveis de NAD+. Por outro lado, verifica-se que o AIF é translocado do citossol para o núcleo, onde promove a condensação e fragmentação da cromatina e o destino desta célula será morte. Por outro lado, o AIF actua no mitocôndrio, promovendo o seu colapso, sendo que ao mesmo tempo verifica-se a libertação do citocromo c com a consequente activação das caspases. No entanto, a activação destas caspases não é essencial para o processo apoptótico pois, a presença de certos inibidores das caspases não é suficiente para inibir este processo , devido à presença do efector apoptótico PARP-1 (Yu et al, 2002).

Como já tinha sido referido, existem vários dados bioquímicos bem como genéticos que indicam que a família das proteases cisteínicas, conhecidas por caspases, desenpenham um papel fundamental na regulação e desenvolvimento do processo apoptótico. As caspases são expressas como proenzimas inactivas sendo que quando as células captam um sinal apoptótico, as caspases tornam-se activas através de um processamento proteolítico. Este, permite a remoção de um pro-domínio terminal, promovendo a formação de subunidades activas que tendem a formar um heterodímero. Assim, estas proteases na sua forma activa, actuam sobre vários substratos vitais, que orquestram os mecanismos bioquímicos da apoptose. Deste modo, os complexos DISC, tais como o TNFR-1 e o Fas, recrutam directamente as proteínas adaptadores TRADD ou FADD/MORT-1, respectivamente, logo após a ligação dos respectivos ligandos. Consequentemente, este mecanismo inicia um processo em cascata, onde as pro-caspases (formas inactivas das caspases) são activadas por proteólise, num processo que começa com a caspase-8 (que funciona como um efector de outras caspases)e termina na clivagem da PARP-1 e na fragmentação do DNA nuclear. (Garland et al., 1998 ; Wetzel et al. 1999)

As células em que as interacções proteína DISC-Ligando não funcionam como efectores primários da apoptose, verificou-se que o processo de activação da cascata apoptótica está relacionado com certos factores pro-apoptóticos libertados do mitocôndrio, nomeadamente o citocromo c. De facto, o estudo efectuado por Garland et al., confirmou que o citocromo c  é um efector primário do processo apoptótico pois permite a indução da via dependente das proteases cisteínicas:

 

Fig. 24- Modelo esquemático que relaciona o metabolismo da IL-3 com a libertação do citocromo c no processo apoptótico; O sinal promovido pelo IL-3 promove a activação de várias vias, nomeadamente, as cinases JAK, o factor de transcrição STAT, Ras, Raf, MAP-K e Atk. A activação da MAP-K, e as necessidades energéticas da célula durante o crescimento, cria uma necessidade de ATP, o que irá provocar um aumento da taxa de glicólise. Simultaneamente,  a proteína raf-1, através  da Bcl-2 e/ou da Akt, promove a fosforilação da proteína BAD, que por sua vez estimula a proteína 14-3-3. Assim, a remoção da IL-3, promove uma diminuição da actividade das proteínas Raf, MAP-K e Atk, bem como uma diminuição nos níveis intracelulares de ATP, com a consequente desregulação da glicólise. Deste modo, a forma desfosforilada da proteína BAD, é estimulada para formar um heterodímero com o complexo mitocôndrial Bcl-2/Bcl-XL, promovendo a libertação do citocromo c independentemente da activação da caspase-3 (CPP32) pela DYm.  (Garland et al., 1998)

 

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No entanto, o mecanismo proposto por Garland et al. necessitava ainda de algumas confirmações, nomeadamente no que diz respeito aos processos de regulação desta via apoptótica.

Assim, o estudo efectuado por Wetzel et al., teve como objectivo identificar a presença de sinais regulatórios da libertação do citocromo c, mais concretamente na capacidade da caspase-8 e de outras caspases em provocar a libertação deste transportador mitocôndrial. (Wetzel et al. 1999)  Desta forma, estes autores verificaram que em células T Jurkat o citocromo c foi libertado após estimulação do receptor apoptótico Fas. No entanto, o mesmo não se verificou quando as mesmas células foram sujeitas a um tratamento com zVAD-fmk (um inibibor das caspases), pois este preveniu a libertação do citocromo c, bem como o processamento proteolítico das pro-caspases-3 e –8 e a consequente morte celular. Assim, estes dados sugerem que a caspase-8 poderá ser um efector do processo de libertação do citocromo c.  (Wetzel et al. 1999)

 

Fig. 25- Em células T Jurkat, citocromo c é libertado do mitocôndrio como resposta ao sinal apoptótico promovido pelo receptor Fas. Este fenómeno é inibido pela presença de zVAD-fmk; (Wetzel et al. 1999)

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Por outro lado, estes mesmos autores, observaram em estudos anteriores que in vitro, a activação das pro-caspases-3 e –8 se processava de forma idêntica na presença ou ausência de citossol. Assim, este fenómeno levantou a questão da contribuição do processo de libertação do citocromo c para a activação das proteases cisteínicas. (Wetzel et al. 1999)

De forma a testar a hipótese do mitocôndrio participar ou não no processo de morte celular mediado pelos receptores Fas e TNFR-1, estes autores procederam à incubação da caspase-8 purificada com citossol. Além disso, ao longo do tempo de incubação foram adicionando quantidades crescentes de mitocôndrios, sendo que a actividade catalítica do enzima foi medida através da conversão do substrato colorimétrico DEVD-pNA. (Wetzel et al. 1999)

 

Fig. 26- a)Medição da actividade catalítica da caspase-8, através a clivagem específica do DEVD-pNA (- sem fracção mitocôndrial (f.m); ·- com f.m. 1% (v/v); - f.m. 5 % (v/v); Ñ- f.m. 10% (v/v); - f.m. 15% (v/v);  b) Caspase-8 promove a libertação do citocromo c; (Wetzel et al. 1999)

 

Como se verifica pela figura 26, a actividade da caspase-8 aumenta significativamente com o aumento da quantidade de mitocôndrios, quando comparado com o controlo (sem fracção mitocôndrial). Assim, o mitocôndrio estimula a caspase-8, pois aumenta a taxa de clivagem do substrato DEVD-pNA, provavelmente através da libertação do citocromo c e da activação do complexo Apaf-1/pro-caspase-9. (Wetzel et al. 1999)

A Bcl-2 bem como  aBcl-XL, possuem a capacidade de inibir o processo de libertação do citocromo c, durante o desenrolar do processo apoptótico. No entanto, e de forma a testar o efeito da Bcl-2 no mecanismo de libertação do citocromo c induzido pela caspase-8, estes autores procederam ao isolamento do mitocôndrio de células que sobre-expressavem a proteína Bcl-2 (células CEM-neo e CEM-Bcl-2). Assim, os mitocôndrios desta linhas celulares foram incubados com extratos citossólicos e caspase-8, sendo que a libertação do citocromo c foi medida por imunoblotting. (Wetzel et al. 1999)

 

Fig. 27– A libertação do citocromo c, induzida pela caspase-8, é retardada pela presença de Bcl-2/Bcl-XL; (Wetzel et al. 1999)

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Deste modo, estes dados sugerem que a libertação do citocromo c pode ser inibida através da presença de moléculas anti-apoptóticas, tais como a Bcl-2 e a Bcl-XL.

Assim, qual será a função desenpenhada pelo mitocôndrio/citocromo c na via apoptótica mediada pelo receptor Fas?

O estudo efectuado por  Wetzel et al. demosntrou que o mitocôndrio poderá constituir um sinal apoptótico, mediante a libertação do citocromo c, em situações onde se verifica a presença de pequenas quantidades de caspase-8. Por outro lado, este processo poderá constituir um passo de regulação uma vez que as moléculas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL possuem a capacidade de inibir este processo. Assim, sumariando, o processo libertação do citicromo c, que é iniciado pelas caspases, poderá funcionar como um mecanismo efector de forma a amplificar o sinal em cascata das caspases e, consequentemente, do mecanismo apoptótico. (Wetzel et al. 1999)

A inibição do sinal apoptótico, induzido pela ASK-1, pelas proteínas 14-3-3

A apoptose, é um processo fisiológico bastante importante pois desenpenha um papel fundamental no desenvolvimento celular bem como na fisiopatologia de várias doenças. Deste modo, ao longo dos últimos anos, foram identificadas uma série de moléculas que participam neste processo altamente coordenado. Destes estudos, também ficou bastante claro que a via apoptótica está intimamente relacionada com as vias que promovem a sobrevivência da célula (anti-apoptóticas), de forma a garantir que o processo apoptótico apenas se desenvolva quando seja necessário. Assim, esta associação é em parte estabelecida através da regulação/relação entre os efectores apoptóticos e os anti-apoptóticos (como exemplo temos a libertação do citocromo c e a regulação deste processo através dos efectores negativos Bcl-2 e Bcl-XL bem como a activação da proteína Atk que promove a sobrevivência da célula, em parte devido à fosforilação de proteínas pro-apoptóticas, tais como a Bad). (Zhang et al.1999)

Por outro lado, a ASK-1, é um componente essencial para o processo apoptótico pois encontra-se envolvido numa série de vias associadas a vários estimulos apoptóticos. De facto, a sobre- expressão da ASK-1 é suficiente para induzir a apoptose em muitos tipos de células. Assim o conhecimento sobre a regulação da apoptose, quer por efectores pro-apoptóticos quer por efectores anti-apoptóticos, poderá fornecer alguns dados bastante importantes para o entendimento deste proceso. Deste modo, o estudo efectuado por Zhang et al. demonstra que a activiade pro-apoptótica da ASK-1 é antagonizada pela ligação de proteínas 14-3-3. (Zhang et al.1999)

Assim, será de esperar que a proteína 14-3-3 interactue com a ASK-1, de uma forma que possa fosforilar alguns substratos essenciais para a sobrevivência da célula. Deste modo, será possível que a 14-3-3 iniba a actividade pro-apoptótica de múltiplas proteínas e, deste modo, actua como um regulador do processo apoptótico. (Zhang et al.1999)

 

Fig. 28- A ligação da proteína 14-3-3 inibe o processo apoptótico induzido pela ASK-1; A- Células HeLa que sobre-expressam ASK-1, demosntram as características nucleares de células apoptótica; B) O processo apoptótico dependente da ASK-1 é mediado pela ligação da proteína 14-3-3; (Zhang et al.1999)

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Apoptose: Uma estratégia do HIV para escapar ao S.I.

Logo após a descoberta do síndrome associado à infecção pelo HIV, tornou-se bastante claro que o envelope glicoproteico (Env) deste vírus possuía uma elevada afinidade para o receptor CD4. Assim, este facto foi prontamente relacionado com a capacidade do vírus HIV poder replicar-se nas células T CD4+(TH), provovando, posteriormente a sua morte (ver secções anteriores do trabalho) (Gougeon. M, 2003).

Como os linfócitos T CD4+ desenpenham um dos principais mecanismos efectores da imunidade anti-viral, foi inicialmente proposto que a imunodefeciência associada à infecção pelo HIV, resulta directamente da morte destas células. No entanto, ao longo dos últimos anos, esta teoria revelou ser demasiado simplista pois os recentes avanços científicos levaram à formulação de novas teorias que tentam compreender/explicar melhor os mecanismos moleculares associados à infecção pelo HIV. (Gougeon. M, 2003)   Assim, para tentar explicar a diminuição do número de células T durante o desenvolvimento desta patologia foram, recentemente, formuladas as seguintes teorias:

-         Produção descontrolda de células T no Timo;

-         Armazenamento das células T específicas para o HIV nos tecidos linfáticos;

-         Alteração da proliferação homeostática de células T CD4+;

-         Aumento da taxa de morte celular devido a uma estimulação apoptótica desencadeada pelo HIV;

Como se pode comprovar pela vasta bibliografia actualmente disponível sobre o HIV, podemos facilmente constatar que ainda persistem diversas questões que necessitam de esclarecimento. Assim, os mecanismos/processos através dos quais este vírus promove a estimulação e o controlo do processo apoptótico, ainda não estão totalmente desvendados. Por isso, após uma pequena revisão sobre os mecanismos associados ao processo apoptótico (importante para esclarecer alguns conceitos inerentes), iremos abordar a relação entre a infecção pelo HIV com o aumento da taxa de morte celular induzida pelo contolo dos mecanismos de apoptose. Nesse capítulo, daremos especial atenção à proteína viral Nef dada a sua importância e relação com os mecanismos apoptóticas das células T infectadas com o HIV .

Aumento da taxa de destruição dos linfócitos T: a acção do HIV

Nos mecanismos que estão envolvidos no aumento da taxa de apoptótica dos linfócitos T infectados com o HIV, podemos incluir:

-         morte directa das células infectadas após expressão dos genes virais;

-         morte das células bystander, promovida pelas proteínas vírais que são libertadas por células infectadas;

-         alteração da expressão das moléculas regulatórias do processo apoptótico nos linfócitos T e APC’s;

Como já foi referido, o processo apoptótico é um mecanismo altamente regulado de morte celular, sendo essencial para a manutenção de uma população estável de linfócitos, por forma a controlar o fluxo contínuo de novos linfócitos bem como a homeostasia e proliferação desta linha celular. Por outro lado, é essencial para o organismo, após uma resposta imunitária contra um determinado antigénio, eliminar/destruir a maioria dos linfócitos activados durante o processo, por forma a evitar os processos de autoimunidade. (Gougeon. M, 2003)

Proteínas virais: a indução do processo apoptótico

Para além da proteína Env, o HIV codifica outras proteínas que, in vitro, possuem a capacidade de desencadear os mecanismos apoptóticos tanto das células infectadas como das não infectadas.

De facto, verificou-se que a via apoptótica intrínseca pode ser desencadeada pela proteína Vpr, provocando um rápido desacoplamento do potencial transmembranar do mitocôndrio e, como consequência, a libertação do citocromo c e a morte celular. (Jacotot, E. et al, 2000) Por outro lado, os vários estudos efectuados demonstraram que a proteína Tat induz a maquinaria apoptótica através da inibição da expressão de BCL-2, num processo acoplado a um aumento da expressão da caspase-8. Além disso, a simples ligação da glicoproteína viral gp120 ao receptor CD4 dos linfócitos T, também promove a inibição da expressão da BCL-2, promovendo-se desta forma o processo apoptótico resultante do colapso energético da célula provocado pela libertação do citocromo c (desacoplamento da cadeia transportadora de electrões). Além disso, alguns estudos também demonstraram que a degradação proteolítica da BCL-2, numa reacção catalisada pela caspase-8 activada pela protease viral, é outros dos factores que contribui para o desencadear do processo apoptóticos nos linfócitos infectados. (Westendorp, M. et al, 1995) (Li, C., et al, 1995)

A influência do HIV na via apoptótica extrínseca (através da estimulação dos receptores apoptóticos), foi documentada quer em células infectadas quer em células bystender. De facto, verificou-se que a formação do complexo gp120-CD4 promove a activação da via apoptótica inerente ao receptor Fas (CD95), verificando-se ainda que, nos linfócitos T infectados, a expresão da proteína Nef promove a co-expressão do ligando FasL na sua membrana. Deste modo, as células que co-expressam a molécula FasL são potencialmente capazes de provocar a morte celular de linfócitos T não infectados. De forma semelhante, a proteína Tat, que é expressa nas células infectadas, promove a indução da síntese proteica de CD95 e CD95L em células não infectadas, aumentando assim a sua susceptibilidade para a via apoptótica inerente a este receptor. (Herbein, G., et al,  1998) Assim, é claramente visível que os dados ciêntíficos recolhidos ao longo dos tempos, demonstram que o HIV possui mecaismos para manipular e controlar os mecanismos apoptóticos das células, por forma a escapar ao sistema imunitário do hospedeiro e provocar a  sua progressiva destruição.(Gougeon, M. 2003)

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ACAD e AICD nos linfócitos T

A relação entre a ACAD (activação autónoma da morte celukar das células T) e a destruição dos linfócitos T induzida pelo HIV, é fornecida pela observação de que, in vitro, as células T de indivíduos seropositivos desenvolvem um processo apoptótico quase espontâneo aquando da ausência de estímulos exógenos. Este facto foi intimamente relacionado com a inibição da expressão da proteína BCL-2 em linfócitos T de indivíduos seropositivos. (Gougeon, M. 2003) Deste modo, a baixa taxa de expressão desta proteína representa um fenótipo característico de células que sofrem apoptose prematuramente, como consequência principal de uma activação imunitária característica de uma exposição contínua e repetida ao HIV. De facto, estes resultados são confirmados no modelo animal fornecido pelo chimpazé pois, a infecção não patogénica que se verifica neste animal está directamente relacionada com a falta de activação imunitária, baixos níveis de apoptose espontânea dos linfócitos T e com uma expressão normal da BCL-2. (Boudet, F. et al, 1996) (Adachi, Y., et al, 1996) Em termos terapêuticos, os mecanismos que envolvem a ACAD são prevenidos por algumas citocinas, IL-2 e IL-15 que, in vitro, promovem a sobrevivência dos linfócitos T através da induçãoda expressãode BCL-2. (Naora, H., et al, 1999)

Por outro lado, os mecanismos que envolvem o processo de AICD (activação indutória da morte celular), são dependentes dos receptores apoptóticos membranares já referidos neste trabalho. De facto, é possível verificar in vivo que o envolvimento de receptor Fas/CD95, em pacientes seropositivos, está concomitantemente relacionado com o aumento da sobre espressão desta molécula na superfície membranar das populações celulares T CD4+ e CD8+, aumentando também a susceptibilidade destas células para desencadearem o processo apoptótico. Assim, uma das formas de diagnóstico será relacionar os níveis plasmáticos da forma solúvel do receptor Fas/CD95 pois, um elevado nível é um marcador característico do desenvolvimento da patologia associada à infecção pelo HIV. Por outro lado, o ligando específico para o receptor Fas/CD95, ou seja a molécula FasL/CD95L, sofre uma indução tanto nas células CD4+ como CD8+ de pacientes seropositivos, sendo este facto relacionado como o aumento da taxa apoptótica nos tecidos linfáticos. A título de curiosidade, a observação de que o ácido retinóico inibe a expressão de CD95L, diminuindo a taxa apoptótica dos linfócitos infectados, suporta as ideias acima refridas ou seja, as interações do comlexo CD95-CD95L, induzidas pelo HIV, são responsáveis pela morte celular dos linfócitos T. Portanto, todos os dados científicos recolhidos até ao momento parecem indicar que a infecção dos linfócitos T pelo HIV promove uma sobre-espressão de determinadas moléculas pró-apoptóticas que aumentam a susceptibilidade das células infectadas para desencadearem o processo apoptótico e, assim, enfraquecer o sistema imunitário do hospedeiro. (Badley A, et al, 1999)

Em relação à via apoptótica induzida pelo complexo TNF-TNFR, os estudos efectuados também demonstram que a infecção pelo HIV também promove o desenvolvimento de desvios significativos em relação a uma situação considerada normal. De facto, estudos recentes demonstraram que as células T CD4+ e CD8+ de indivíduos seropositivos são bastante susceptíveis  para o desenvolvimento dos mecanismos apoptóticos desencadeados pelos receptores TNFR-1 e TNFR-2. No entanto, sabe-se que este mecanismo não está associado com o aumento da expressão membranar destes receptores, nem com um aumento da expressão de TRADD, RIP ou TRAF2, estando sim, associado com a inibição da síntese de BCL-2. (De Oliveira, et al, 2002)

Nas células T de indíviduos seropositivos, a ligação/estimulação dos receptores apoptóticos da famíla TNF, origina a activação de uma série de caspases, nomeadamente a caspase-3 e a caspase-8. Este facto é perfeitamente comprovado pela observação in vivo de que em células T CD4+ e CD8+ de pacientes seropositivos existe um elevado nível de expresão destas caspases sendo que, in vitro, a activação destes enzimas poderá ser induzida pela presença das proteínas virais Tat, Env, Nef ou Vpr. Portanto, é perfeitamente plausível afirmar que a progressão da infecção pelo HIV está intimamente relacionada com o aumento da actividade enzimática das caspases. (Cicala el al,2000) Como as células T CD4+ possuem a capacidade de promover a indução da expressão do CD95L, quer pela infecção in vivo com o HIV quer pelo efeito provocado

pelas proteínas virais gp120, Tat ou Nef, estas células tornam-se potenciais destruídoras (killers) de outras células que expressem o receptor CD95. Esta hipótese é confirmada in vitro através da observação de que células CD4+ que expressam a molécula CD95L possuem a capacidade destruir CD8+ que expressam o receptor CD95.

 

Figura 29- Vias apoptóticas desencadeadas pelo HIV, em células infectadas; A via extrínseca é iniciada pela ligação dos ligandos específicos para os receptores da familia TNF. Através dos seus domínios efectores de morte (DED’s), que facilitam das pro-caspases-8 e –10, verifica-se a formação de um complexo indutor do sinal de morte (DISC).  Fazendo parte deste complexo, as caspases são clivadas de maneira a originar a sua forma activa e a iniciar os mecanismos intrínscos a esta via apotótica. Assim, a proteína BID é clivada enzimáticamente, numa reacção que origina a forma truncada desta proteína ,(t)BID, e a activação da cascata promovida pelas caspases. Os mecanismos apoptóticos induzidos pelos receptores membranares podem ser bloqueados pela proteína FLIP, cujo mecanismo de acção inibe o processamento proteolítico da casase-8. As proteínas virais gp-120, Nef e Tat promovem a indução da expressão do receptor Fas/CD95 bem como do respectivo ligando (FasL/CD95). Além disso, a proteína Tat promove a expressão do ligando apoptótico TRAIL bem como aumenta a taxa de processamento proteolítico da caspase-8. Por sua vez, a proteína Nef e a gp-120 aumentam a actividade da caspase-3. A via apoptótica intrínseca é iniciada por sensores internos, como a proteína p53, que activa as proteínas contendo BH3, promovendo o acoplamento de membros pro-apoptóticos da família BCL-2 (BAX e BAK), em poros hetero-oligoméricos na membrana mitocondrial. Deste processo resulta a libertação de factores pro-apoptóticos, tais como o citocromo c, SMAC e HtrA2/OMI, para o citoplasma.Deste modo, observa-se a perda do potencial membranar do mitocôndrio, num pocesso que pode ser bloqueado pelas proteínas anti-apoptóticas BCL-2/BCL-XL. A libertação do citocromo c promove a formação de um apoptosoma , que inclui o factor APAF-1 e a pro-caspase-9. A activação auto-proteolítica da caspase-9 inicia os mecanismos efectores da vias promovida pelas caspases, num processo que é regulado negativamente pelos IAP´s e positivamente pelo SMAC.  (Gougeon. M, 2003)

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Por outro lado, os macrofágos que expressam o CD95L também possuem o potencial para destruírem linfócitos T-CD95 não infectados, num mecanismo não restritivo para os MHC mas dependentes dos receptores CD95/TNFR.

 

Proteína Viral Efectora

Mecanismo

Pró-Apoptótica

Tat

Indução funcional da via CD95-CD95L

Indução da proteína TRAIL pelos macrófagos

Aumento da actividade da caspase-8

Inibição da expressão da BCL-2

Inibição da superóxido dismutase

Nef

Indução funcional da via CD95-CD95L

Activação da via das caspases

Inibição da exressão de CD4 e MHCI

Vpr

Dissipação do potêncial do mitocôndrio

Activação das caspases

Paralisação do ciclo celular na fase G2

Vpu

Aumento da susceptibilidade para a via CD95

Env (gp120/gp160)

Indução da exressão de CD95 nos linfócitos

Activação da caspase-3

Apoptose das células CD8+ dependente de CXCR4/TNFR2

Formação de “Syncytias” e apoptose

Fosforilação da p53 mediada pela MTOR

Diminuição da expressão da BCL-2

Protease

Activação da caspase-8 e degradação proteolítica da BCL-2

Anti-Apoptótica

Tat

Activação do ciclo celular

Nef

Inibição da expressão de CD4 em células infectadas, evitando o processo apoptótico induzido pela g120;

Inibição da síntese de moléculas MHC I, protegendo as células infectadas dos CTL’s

Vpr

Indução da BCL-2 e inibição da BAX

Vpu

Inibição do CD4 de células infectadas

Env

Inibição do CD4 de células infectadas

Tabela II: Proteínas virais e os mecanismos associados no controlo da morte celular dos linfócitos; ( Adaptado de Gougeon, M., 2003)

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Proteína Nef/HIV-1: “Um convite para a morte”

A expressão genética do vírus HIV-1 poderá ser dividida em duas fases distintas: uma fase inicial regulatória e uma fase final, predominantemente estrutural. Assim, na fase regulatória, apenas três dos genes virais são expressos, sendo que apenas dois são essenciais para o ciclo de replicação do vírus (proteínas Tat e Rev), apesar dos mecanismos de acção destas proteínas ainda não serem totalmente conhecidos. (Cullen, 1999) Surpreendentemente, a terceira proteína viral desta fase inicial, denominada por Nef/HIV-1, possui níveis de expressão bastante mais elevadas que as proteínas Tat e Rev, apesar deste polipeptídeo não ser essencial para a replicação in vitro do vírus. A primeira demonstração in vivo de que a proteína Nef é necessária para a replicação viral bem como para o desenvolvimento da patogénese SIV é fornecida por Kestler et al (Kestler et al.1991) No entanto, os esforços desenvolvidos para tentar defenir in vivo as funções exactas da proteína Nef permitiram concluir que esta actua por diversos mecanismos distintos. (Cullen, 1999)

Vulgarmente a interacção entre o vírus e o respectivo hospedeiro, resulta na morte das células infectadas. No entanto, em certos casos, estes vírus podem beneficiar de tal reacção citopatológica pois este facto poderá facilitar a exocitose de novas partículas virais da célula infectada. Por outro lado, a morte prematura da célula hospedeira poderá resultar num processo abortivo para o ciclo reprodutivo do vírus e, portanto, o controlo dos processos de morte celular reveste-se de grande importância.

Deste modo, e apesar dos vírus poderem desenvolver alguns processos específicos para destruir o seu hospedeiro, também poderão explorar os mecanismos celulares pré-existentes de forma a aumentarem o seu grau de virulência  (Tolskaia et al. 1995).

A proteína HIV-Nef (27 kD) é um factor regulatório bastante importante, sendo expressa em concentrações bastante elevadas logo após a infecção viral. No entanto, in vitro, esta proteína não é essencial para a replicação viral nem para a citotoxicidade que se verifica. Deste modo, alguns estudos experimentais demonstraram que estirpes mutantes dos vírus HIV e SIV, que possuíam uma delecção do gene codificante da proteína Nef, eram menos patogénicos sendo que a diminuição do número de células T se processava numa taxa bastante inferior. Consequentemente, as propriedades da proteína Nef têm sido intensamente estudadas ao longo da última década (a literatura contem mais de 9000 publicações) sendo que lhe foram atribuídas muitas funções. Assim, verificou-se que a Nef aumenta sinergeticamente a activação das células T possuindo a capacidade de ligação ao domínio SH3 da família das cinases tirosínicas (caspases). De facto, verifica-se que a interacção entre o Nef e estas cinases é potencialmente importante pois estas proteínas estão directamente envolvidas nas vias de comunicação intracelulares podendo, por isso,  ser responsáveis tanto pelo aumento da taxa de replicação viral como do grau de virulência do vírus. Por outro lado, o Nef também possui a capacidade de inibir a expressão das moléculas que se dispõem na superfície das células infectadas. De facto, o receptor CD4 (aquele que está envolvido na entrada do vírus para a célula), sofre um processo de endocitose, sendo posteriormente alvo de um mecanismo de degradação. Assim, pensa-se que a diminuição dos níveis deste receptor na superfície celular é um mecanismo bastante importante para o vírus, ou seja, diminui a probabilidade de novas partículas virais re-infectarem a célula, aumentando desta forma a eficiência de disseminação do vírus.

Por uma via distinta, o Nef também possui a capaciade de downregulate a expresão dos MHC classe I (Major Histocompatibility Complex) nas células infectadas, o que lhe confere uma protecção parcial contra os “efeitos de lise” provocados pelas células T citotóxicas. Por outro lado, a proteína Nef consegue, ainda, provocar/promover a disseminação do HIV-1, a partir de macrófagos infectados, num processo regulado pela transcrição de uma proteína MIP-1a/b (Macrophage-inducing protein 1a e b), bem como de um outro factor não identificado até hoje, cujo mecanismo de acção permite activar as células T, expondo-as ao perigo de infeccção.

Simultaneamente, encontra-se descrito na bibliografia que a proteína HIV-Nef possui a capacidade de induzir a expressão do FasL. Deste modo, a upregulation do ligando FasL nas células T infectadas é mediada, em grande parte, pela interacção do Nef com a cadeia z do receptor destas células. Assim, o Nef não só protege as células infectadas da acção citotóxica dos linfócitos T (através da redução da expressão do MHC classe I), bem como podem induzir as células T a usar o FasL para “combater” e induzir o processo apoptótico mediado pelo receptor Fas nos linfócitos T citotóxicos específicos para o vírus. No entanto, a expressão do ligando FasL nas células T CD4+ infectadas poderá provocar um problema para o vírus: estas células demonstram um fenótipo activado e expressam o receptor Fas. Deste modo, poder-se-á pensar que as células infectadas com o HIV poder-se-iam auto-destruir. No entanto, observa-se in vivo que a taxa de replicação viral ao longo de uma infecção provocada pelo HIV-1, promove a sobrevivência das células infectadas. Por outro lado, um aumento do tempo de vida das células infectadas é claramente um factor importante pois permite a maturação e a disseminação do vírus. Portanto, não será surpreendente que muitos vírus tenham desenvolvido uma estratégia de forma a proteger as células infectadas do hospedeiro dos processos apoptóticos, quer sejam eles desencadeados intracelularmente quer através de uma resposta do sistema imunitário.

            Como está extensamente referido na bibliografia, os indivíduos infectados com o HIV-1 sofrem uma diminuição progressiva do número de células T CD4+. Consequentemente, o sistema imunitário do hospedeiro é enfraquecido sendo que este facto poderá dar origem a várias patologias infecciosas oportunistas. As evidências que confirmam este facto demonstram que a variação dos níveis das células T está intimamente associada com um aumento brusco do processo apoptótico dos linfócitos do sangue, nódulos linfáticos, timo e outros tecidos linfáticos. (Xu et al, 2001)

 

Fig. 30- Mecanismo propostos para a diminuição progressiva dos níveis de linfócitos T CD4+ em indivíduos infectados pelo HIV-1 (McCune, 2001);

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Pelo facto do vírus HIV-1 ser predominantemente linfotrópico, ou seja, possuir uma grande afinidade para os linfócitos (especialmente os CD4+), pensou-se inicialmente que a destruição destas células ocorreria através de uma via citopática directa. No entanto, algumas evidências recentes indicam-nos que existem certos mecanismos adicionais através dos quais o HIV-1 promove o aumento do processo apoptótico e que são distintos dos provocados por uma infecção directa.

Durante o ciclo de vida do vírus, apesar de se verificar um aumento de partículas virais e a consequente diminuição dos níveis de células T CD4+ (pois a taxa de morte celular aumenta), a maioria das células não se encontra infectada pelo vírus. Deste modo, num estudo recente efectuado, Geleziunas et al propuseram que a proteína viral Nef poderia aumentar a protecção das células infectadas contra a morte celular programada através da inibição de certos receptores apoptóticos dos linfócitos infectados. Portanto, este facto poderá sugerir um novo mecanismo através do qual o HIV-1 regula o processo de morte celular durante o período de infecção. Assim, o aumento do processo de morte celular nestas células é, em grande parte, mediado através da proteína Nef que induz a expressão do ligando Fas (FasL) na superfície das células T infectadas. Consequentemente, a interacção deste com o respectivo receptor (Fas/CD95), presente em células vizinhas incluindo os linfócitos T citotóxicos específicos para o HIV-1, poderá promover o processo apoptótico destas células e assim, originar um mecanismo importante para o enfraquecimento do sistema imunitário do hospedeiro (Geleziunas et al, 2001).

Apesar do HIV-1 também aumentar os níveis de expressão do receptor Fas em células infectadas, permanece por esclarecer o(s) mecanismo(s) pelo(s) qual/quais as células infectadas evitam o processo autónomo de apoptose induzido pela interacção do receptor Fas com o respectivo ligando (FasL). Assim, estes autores demonstraram que a proteína viral Nef inibe o sinal apoptótico regulado pela cinase 1 (ASK-1)- cinase serina/treonina que origina um sinal regulatório intermédio nas vias apoptóticas promovidas pelos receptores Fas e TNF-a. Assim, estes resultados demonstram a estratégia pela qual a proteína Nef promove a morte celular induzida pelo FasL enquanto, espontaneamente, protege as células hospedeiras infectadas pelo HIV-1 destes mesmos sinais pro-apoptóticos através da interferência com a função da proteína ASK-1. (Geleziunas et al,2001)

Fig. 31 - Mecanismo de acção do Nef na inibição do processo apoptótico em células  T CD4+ infectadas; (Geleziunas et al,2001)

 

Fig. 32 - O efeito inibitório da proteína Nef nas vias apoptóticas induzidas pelos receptores Fas e TNF-R; (Xu et al., 2001)

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A primeira propriedade do Nef a ser claramente definida, foi a capacidade que esta possui em inibir a expressão do receptor  CD4 na superfície dos linfócitos T. De facto, demonstrou-se que esta regulação permite aumentar a eficiência da taxa de disseminação do HIV-1, pois previne uma nova re-infecção das células previamente infectadas (Lama et al., 1999; Ross et al., 1999). Por um mecanismo aparentemente diferente, a proteína Nef também possui a capacidade de regular selectivamente a expressão das moléculas do MHC classe I pois, pensa-se que este fenómeno de regulação evita que as células infectadas com o HIV-1 apresentem na superfície celular os antigénios, fornecendo desta forma uma protecção parcial contra os efeitos citotóxicos desencadeados pelos linfócitos T. (Collins et al., 1998) Por outro lado, existem ainda algumas evidências de que os viriões do HIV-1 produzidos na presença de Nef, são ligeiramente mais infecciosos que os viriões produzidos na ausência desta proteína. (Cullen, 1998)

Apesar de se poder pensar que estas três actividades biológias poderão ser adequadas para esta proteína, que apenas possui um tamanho de 27 kDa, existem várias evidências de que a Nef poderá afectar o estado de activação das células. (Skowronski et al., 1993) De facto, existem vários estudos que demonstram que a interacção entre a Nef e outras proteínas celulares, tais como a Hck ou a Vav, poderá alterar o estado de activação celular. Apesar disto, a relação entre este facto e o aumento da taxa de replicação viral in vivo, permanece por esclarecer.

No entanto, o estudo efectuado por Swingler et al., parece ter a resposta para este problema, uma vez que demonstrou que a infecção de macrófagos pelo HIV-1, ou por um adenovírus que expresse a proteína Nef, resulta em duas consequências fenotípicas bastante importantes. A primeira, deriva do facto dos macrófagos segregarem as “chemokines” MIP-1a e MIP-1b como resposta à expressão da proteína Nef. Estas “chemokines” promovem a “chemotaxis” dos linfócitos T inactivos, aumentando desta forma a probabilidade destas células serem infectadas por viriões do HIV-1 libertados pelos macrófagos. Por outro lado, este estudo, também demonstrou que os macrófagos que expressam a proteína Nef, segregam alguns factores não identificados que permitem atrair os linfócitos T e, assim, aumentar a eficiência da disseminação do vírus (fig.32) (Swingler et al, 1999). Assim, os resultados desta investigação indicam que os macrófagos desempenham um papel fundamental na eficiência de disseminação do HIV-1 in vivo. No entanto, a proposta de que a proteína Nef possui a capacidade de activar directamente as células T não é sustentável, uma vez que estas células na forma inactiva não poderiam suportar a infecção pelo vírus e, portanto, não poderiam expressar a proteína Nef.  Assim, a identificação dos factores que activam as células T e, que são secretados após a expressão da proteína Nef, bem como a regulação da segração destas substâncias poderá ser bastante importante para a investigação nesta área.

 

Fig. 33 - A proteína Nef promove a disseminação do HIV-1 a partir de macrófagos infectados. Na ausência da proteína Nef, os macrófagos infectados (M) produzem viriões mas, a capacidade destas partículas em infectar células T em repouso (azul) é pouco eficiente. De acordo com Swingler et al., a proteína Nef promove o poder de infecção de duas formas: i) induz o magrófago a secretar partículas MIP-1a (verde) e MIP-1b (vermelho), que atraem os linfócitos para os macrófagos infectados; ii) induz os macrófagos para a produção de um factor X não identificado, que activa as células T (laranja), promovendo desta forma a produção de viriões; (Cullen, 1999)

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O estado de imunodeficiência que define a patologia SIDA, caracteriza-se pela diminuição progressiva tanto do número de células T CD4+, bem como da sua respectiva função. Desta forma, alguns estudos recentes demonstram que em indivíduos infectados com o HIV-1, a taxa desta depleção situa-se na ordem de 3.5x107 e 2x109 células por dia. Por outro lado, as causas responsáveis por este fenómeno incluem mecanismos directos bem como indirectos, sendo que nos últimos anos foram identificados alguns mecanismos indirectos em estudos in vitro. Assim, o mecanismo apoptótico tem sido proposto como um potencial responsável pela diminuição do número de células T CD4+, bem como de uma desregulação do sistema imunitário que poderá originar o desenvolvimento de vários processos patogénicos, tendo sido estes factos demonstrados tanto in vitro como in vivo. No entanto, os agentes que provocam os estímulos apoptóticos bem como os receptores responsáveis pela indução do processo de morte celular nos linfócitos infectados permanecem por identificar (Badley et al, 2000).

Uma característica comum entre os mecanismos apoptóticos que ocorrem in vivo e in vitro, é a necessidade de existir uma activação celular para o desenvolvimento da apoptose. Assim, ao longo dos últimos anos, os estudos efectuados sobre a biologia do processo apoptótico, indicam a presença de vários receptores celulares que promovem o mecanismo de morte celular programada. Dentro deste conjunto de receptores, o Fas é um dos responsáveis pela indução da apoptose pois, quer através da interacção com o respectivo ligando (FasL) quer de um anticorpo específico, verifica-se a morte da célula. De facto, alguns estudos recentes, demonstram que a interacção Fas-FasL, em conjunto com a activação do receptor CD4+, origina o desencadeamento do processo apoptótico em células T. Assim, a activação dos receptores destas células parece ser uma característica comum entre o processo apoptótico induzido pelas interacções Fas-FasL e o processo desenvolvido in vitro em células infectadas com o HIV-1. Por outro lado, os linfócitos T de pacientes infectados demonstram possuir um grau de activação superior, em relação a indivíduos seronegativos e, estas células também demonstram possuir níveis de expressão do receptor Fas, bastante superiores. Assim, o conjunto destes dados sugere que os linfócitos T de indivíduos infectados possuem uma susceptibilidade superior para desencadear o processo apoptótico. (Badley et al, 2000)

Até ao estudo efectuado por Badley et al, a expressão do FasL apenas tinha sido demostrada em células linfóides, não se verificando o mesmo para os monócitos. No entanto, alguns estudos efectuados demonstraram que a presença de células acessórias, tais como os macrófagos, possuíam a capacidade de intervir no fenómeno de diminuição do número de células T, após a infecção pelo HIV-1. Assim, o processo de apoptose dos linfócitos nos nodos linfáticos de indivíduos infectados, poderá ser mediado por células acessórias que possuam a capacidade de provocar a morte célular de linfócitos T não infectados. Consequentemente, poder-se-á pensar que a regulação das interacções Fas-FasL poderá desenpenhar um papel fundamental na patogénese provocada pela infecção com o HIV-1. No entanto, o(s) mecanismo(s) através do(s) qual(ais) o HIV-1 promove o aumento da expressão do FasL, permanece por estudar. (Badley et al, 2000)

Deste modo o estudo efectuado por Badley et al, demonstra que é possível detectar mRNA codificante do FasL em macrófagos não infectados, apesar do mecanismo responsável pela capacidade destas células em expressar esta proteína na superfície celular e, consequentemente desencadear o processo apoptótico noutras células que expressem o receptor Fas na sua superfície, ser desconhecido. De facto, o estudo efectuado confirma que os macrófagos, se estiverem infectados, poderão induzir o processo apoptótico em células T CD4+. Assim, a expressão do FasL nos macrófagos, induzida pelo HIV-1, poderá amplificar a eficiência do vírus, uma vez que este fenómeno promove a diminuição do número de células T dos indivíduos infectados. (Badley et al, 2000)

A proteína Nef bloqueia o processo apoptótico induzido pela replicação do HIV:

De forma a estudar se a fosforilação da proteína Bad dimunui ou não a taxa apoptótica das células infectadas, Wolf et al manipularam o genoma do HIV de forma a que este expresse um “tag” do CD8 a montante da ORF nef/nef.APVA. Assim, as células onde se observe o ciclo de replicação do vírus verificar-se-á a expressão do receptor CD8 e, portanto, poderão ser monitorizadas pela técnica FACS. Deste modo, estes investigadores transferiram estes vírus para celulas T Jurkat e analisaram a afinidade destas para o corante An-V e/ou para a expressão do CD8, 6 dias após a transfection. Até ao quarto dia, a taxa de expressão do CD8 é constante, sugerindo este facto que a proteína Nef não possui nenhuma influência na actividade do LTR nesta linha de células. No entanto, no 5º e 6º dia a percentagem de células CD8+ aumentou significativamente com o vírus manipulado que expressa o Nef wild type. Apesar de a taxa de expressão de CD8 ser constante até ao 4ºdia, a libertação de partículas virais aumentou entre 5 e 6 vezes no 3º e 4º dia e foi cerca de 7 vezes superior no 6º dia para o vírus HIV/Nef wild type. Apesar deste aumento poder estar relacionado com os efeitos anti-apoptóticos promovidos pelo Nef, estes investigadores foram determinar a percentagem de células CD8+ viáveis (esta análise foi efectuada no terceiro e quarto dia após a transfection). Assim, verificou-se que a percentagem de células vivas no ensaio em que está envolvida a estirpe HIV/Nef wild type é cerca de duas vezes superior em relação ao ensaio em que se utiliza o HIV/Nef.APVA. Posteriormente, quando se procede à incubação destas células durante 12 horas com wortmannin (inibidor da cinase PI3), esta diferença foi praticamente abolida. Para confirmar os resultados, foi analisada a susceptibilidade das células CD8+ viáveis, da população de células com 4 dias, para a expressão do An-V. Assim, verificou-se que as células Nef.APVA possuem uma afinidade superior para o An-V em relação às células Nef wild type e, portanto, desencadearam o processo apoptótico. Desta forma, estes resultados suferem que a proteína Nef poderá bloquear o processo apoptótico através de um mecanismo dependente da cinase PI3 e da proteína PAK. (Wolf et al, 2001)

Ao longo dos últimos anos, alguns trabalhos experimentais demostraram que é característico de alguns vírus patogénicos a regulação/desregulação do processo apoptótico das células. Ultimamente, tem-se verificado que a replicação do HIV provoca a morte celular das células infectadas. No entanto, na fase inicial do ciclo de vida deste vírus, este possui a capacidade de evitar ou bloquear o processo de apoptose, até que as novas partículas virais sofram exocitose. De facto, o estudo efectuado permite confirmar estas afirmações uma vez que a quantidade de partículas virais libertadas de células infectadas está correlacionada com o sinal anti-apoptotico induzido pela proteína HIV/Nef. Além disso, estudos recentes demonstraram que a proteína Nef possui a capacidade de inibir o processo apoptotico, induzido quer pelo receptor Faz quer pelo TNF-R1, através do bloqueio da cinase serina/trionina e da ASK-1. Assim, o HIV possui uma estratégia semelhante ao vírus do herpes bloqueando várias vias apoptóticas, evitando, deste modo, a morte prematura da célula. (Wolf et al, 2001)

 

Fig.34- A proteína Nef bloqueia dois sinais apoptóticos diferentes; (A) Os sinais apoptóticos promovidos pelos receptores Fas e TNFR necessitam da activação da proteína ASK-1; A proteína Nef bloqueia a acção da ASK-1, necessária para o desencadeamento do processo apoptótico; (B) O distúrbio da homeostasia celular pode induzir um sinal apoptótico mediado pelo mitocôndrio e a família das proteínas BCL-2; A proteína Nef bloqueia este sinal através da fosforilação da proteína Bad, num processo dependente das cinases PI-3 e Pak. (Fackler et al, 2002)

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Alguns vírus codificam, no seu genoma, homólogos celulares da proteína Bcl-2 sugerindo, este facto, que a manipulação deste regulador do processo apoptótico poderá ser particularmente eficiente. Assim, a fosforilação da proteína Bad e a consequente inactivação promovida pelo complexo Nef/PAK, será, provavelmente, tão eficiente como a sobrexpressão de homólogos celulares da Bcl-2.

Assim, estes dados sugerem que o Nef possui funções anti-apoptóticas, desempenhando um papel bastante inportante na complexa estratégia desenvolvida pelo HIV para aumentar a eficiência da sua disseminação (Wolf et al, 2001).

Como já foi referido, a proteína HIV/Nef desempenha uma função importante mas, pouco esclarecida, na progressão clínica da patologia. Alguns estudos in vitro demonstraram que esta proteína possui vários efeitos biológicos, incluindo o aumento do poder de infecção dos viriões, downregulation da expressão do receptor CD4 e do MHC I bem como na regulação de vários mecanismos intracelulares, sendo que o efeito positivo do Nef no aumento do poder de infecção viral, requer a sua expressão nas células hospedeiras. Por outro lado, existem algumas evidências que sugerem que esta proteína não altera o processo de entrada do vírus para as células do hospedeiro apesar de promover a síntese do DNA pró-viral, realçando a acção bilológica do Nef ao nível do processo de fusão membranar bem como da transcriptase reversa. Contudo, estes estudos não tiveram em conta que o processo de entrada viral efectua-se não só por fusão membranar como também por endocitose. De facto, no estudo efectuado por Schaeffer et al. a utilização da técnica de microscopia epifluorescente, de forma a monitorizar a entrada de viriões do HIV ligados a uma proteína fluorescente, em células HeLa, permitiu verificar que o processo endocitose também constitui uma forma eficaz para o processo de entrada do vírus nas células hospedeiras. Assim, este estudo permite concluir que o Nef promove significativamente a entrada do HIV para o citoplasma das células hospedeiras, processo este mediado tanto pelos receptores chemokine como pelo CD4. Deste modo, estes factos sugerem que o Nef actua, em parte, como regulador da entrada viral citossólica, contribuindo para o aumento da taxa de disseminação do vírus. (Hazenberg et al, 2000) (Cullen, 1999)

 

Fig. 35- Modelo esquemático que resume as duas vias de entrada do HIV na célula:  i) mecanismo de fusão membranar dependente dos receptores chemokine e CD4; ii) processo de endocitose (independente de receptores); A via de fusão membranar promove a replicação e a disseminação viral, enquanto que, geralmente, a endocitose não induz a uma infecção tão eficaz; (Schaeffer et al. 2000)

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No entanto, o mecanismo directo através do qual o vpu interfere com a molécula CD4 permanece por esclarecer apesar de alguns estudos recentes demostrarem in vitro a ligação da proteína codificada por este gene à cauda citoplasmática da molécula CD4. (Schaeffer et al. 2000) ( Badley et al, 2000)  (Hazenberg et al, 2000)

Apesar de existirem vários estudos relacionados com o mecanismo de regulação do receptor CD4 por cada um dos genes virais, nenhum deles contribuiu para o esclarecimento do mecanismo individual na regulação da expresão do referido receptor. Assim, permanece por esclarecer a função independente de cada gene bem como a extensão que possui na regulação da molécula CD4. Por outro lado, não existem dados suficientes para saber se existem, de facto, efeitos de cooperatividade entre estes genes durante a infecção das células hospedeiras. Assim, o estudo efectuado por Chen et al demonstrou sistematicamente os efeitos individuais e combinatórios que os genes vpu, env e nef possuem na molécula CD4 de células T. De forma a monitorizar estes efeitos durante os diferentes estádios da infecção viral, estes investigadores desenvolveram um sistema que permite examinar quantitativamente as células T por citometria de fluxo. Assim, de forma a distinguir as células infectadas, na fase inicial ou na final, das células não infectadas o vírus HIV foi manipulado de forma a expressar a fosfatase alcalina da placenta humana (PLAP) com uma cinética de expressão tanto na fase inicial como na final, dependendo do gene que se pretende estudar. Deste modo, os resultados obtidos demonstram que os três genes possuem a capacidade independente de regular a expressão do receptor CD4. De facto, e como seria de esperar pelos respectivos padrões de expressão, o gene nef regula a molécula CD4 na fase inicial da infecção enquanto os mecanismos de modulação associados aos genes vpu e env verificam-se, predominantemente, na fase final. Contudo, verificou-se que a combinação destes três genes é bastante mais eficiente que qualquer um dos outros, demonstrando que os três genes são necessários para atingir a regulação máxima da expressão do receptor CD4. (Chen et al, 1996)

 

Fig. 36– Organização genómica e constituição do mRNA de HIV recombinantes modulados de modo a expressarem a PLAP. O vírus modelo HXB-2D encontra-se no topo da imagem e a inserção do PLAP nas sequências do nef e no env estão ilustradas  em seguida. O HXBnPLAP contém um gene PLAP inserido no terminal 5’ do nef. Por sua vez, o  HXBePLAP contém o gene PLAP inserido, também, no terminal 5’ do env. (Chen et al, 1996)

 

Como já tinha sido referido, o processo apoptótico desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da imunodeficiência adquirida através da diminuição dos linfócitos CD4+ e CD8+. Deste modo, usando uma estirpe viral manipulada para expressar uma proteína fluorescente, Mahlknecht et al mediram a taxa apoptótica de linfócitos T CD4+, quer na presença ou na ausência de macrófagos. Assim, a presença destas células em culturas de linfócitos infectados, diminuiu a frequência de células apoptóticas. O aparecimento destas, in vitro, requer o contacto intercelular entre macrófagos e linfócitos bem como a expressão da proteína Nef. Além disso, a presença dos macrófagos não reduz a apoptose aquando da infecção dos linfócitos T CD4+ pelo vírus manipulado de forma a não expressar a proteína Nef. Por outro lado, a expressão do receptor TNF na superfície celular dos macrófagos previne a apoptose em linfócitos T CD4+ infectados com a estirpe wild type. (Mahlknecht et al,2000)

De um modo similar, mediante a estimulação induzida pelo TNF, verifica-se uma diminuição da taxa apoptótica em células T Jurkat “transfected” com um plasmídeo contendo o gene nef. Consequentemente, a estimulação referida resulta numa hiperactivação do NF-kB, que está relacionado com a indução de alguns estímulos anti-apoptóticos. Portanto, a sobrevivência dos linfócitos T CD4+ infectados requer a expressão do gene viral nef assim como a activação pela expressão do TNF na superfície de macrófagos, sendo este fenómeno responsável pela existência de reservatórios virais em indivíduos infectados com o HIV. (Mahlknecht et al,2000)

Contudo, a inibição do processo apoptótico através de agentes farmacológicos em linfócitos T CD4+ infectados, tem aumentado a replicação viral. Assim, sugere-se que a resistência ao mecanismo de apoptose provoca a produção de viriões e favorece, in vivo, uma infecção persistente. (Mahlknecht et al,2000)

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