[Universidade de Evora] UNIVERSIDADE DE ÉVORA
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Engenharia Genética - Clonagem de DNAs em Bactérias (Módulo I)
ACÇÃO FOCO - 1999
Docente Responsável:
Prof. Carlos Sinogas


HOSPEDEIROS PARA CLONAGEM MOLECULAR

MÁRIO SILVA


SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

O que é clonar?

O que é um vector?

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Tipos de células hospedeiras

Hospedeiros procarióticos

Hospedeiros eucarióticos

BIBLIOGRAFIA


INTRODUÇÃO

A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenómeno comum na natureza. Vírus como o fago l têm a capacidade de inserir o seu genoma no cromossoma de E. coli. Neste processo, eles podem mudar o conteúdo genético da célula e por vezes uma bactéria torna-se patogénica, ao receber nova informação genética de um vírus. Por exemplo, quando a bactéria Corynebacterium diphtheriae é infectada por um vírus b , produz-se uma toxina que é responsável pelos sinais e sintomas da difteria. O genoma viral que codifica a toxina insere-se no cromossoma bacteriano sob a forma de um provírus. Esta alteração genética na bactéria, causada pelo vírus, conhecida como "conversão lisogénica", é um exemplo de engenharia genética na natureza.

Houve descobertas em biologia molecular, que permitiram aos cientistas reproduzir no laboratório este fenómeno natural e desenvolver métodos para introduzir quase todo o tipo de informação genética num organismo. A maior parte destes avanços envolve a manipulação genética de bactérias como E. coli e B. subtilis, e a levedura S. cerevisae para a produção de bens de consumo, especialmente aqueles que são muito caros ou virtualmente impossíveis de produzir pelos métodos tradicionais (quadro I).

Fez-se progressos consideráveis no sentido de introduzir genes em animais e plantas para curar doenças genéticas, aumentar a produtividade das plantas e do gado e tornar os cereais mais resistentes a doenças. Por exemplo, introduz-se muitos genes em plantas para as tornar resistentes a insectos e a plantas infestantes. Muitos cientistas estão a tentar introduzir em alguns cereais como o trigo, o arroz, a cevada e o milho, os genes bacterianos para a conversão do azoto atmosférico em amónia. Isto permitiria o crescimento dos cereais sem a necessidade de adição de fertilizantes de azoto, bastante dispendiosos e muitas vezes prejudiciais ao meio ambiente (figura 1).

 

Figura 1- Plantas transgénicas.

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Quadro I- Alguns benefícios da biotecnologia.

Hibridoma

Anticorpos

Proteínas

Insulina
lnterferão
Albumina sérica humana

Hormona humana do crescimento

Activador plasminogénico de tecidos

Antitrombina

Factores de coagulação do sangue

Luciferase (pirilampo)

Linfocinas
Factor da necrose tumoral

Gonadotropina humana

Agricultura

Cereais resistentes a doenças

Tomates hidropónicos

Resistência a pesticidas

Bio-insecticidas

Fixação do azoto

Vacinas

Hepatite B

Herpes

Gripe

Malária

 

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O que é clonar?

Clonar é um processo em que se insere um fragmento de DNA num plasmídeo ou no cromossoma de um fago sendo-lhe permitido replicar-se para produzir numerosas cópias do DNA. A replicação tem normalmente lugar quando o plasmídeo ou cromossoma fágico se introduzem num hospedeiro apropriado (ex: uma bactéria ou uma célula de levedura) e o aparelho de síntese do DNA do hospedeiro replica o DNA inserido na célula hospedeira.

Normalmente, o DNA dador corresponde a uma pequena porção do genoma de uma célula e encontra-se representado por uma ou duas cópias por célula. Logo, antes de se poder extrair o DNA dador tem de se obter, a partir quer um pequena porção de tecido, quer de uma cultura de células, um número suficiente de células desejado. Depois de se ter obtido um número suficiente de células contendo o material genético pretendido, cada célula tem que ser rebentada e o material genético extraído.

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Figura 2- Diagramas de vectores de clonagem simples derivados de um plasmídeo. O plasmídeo pode transportar um ou mais genes que lhe confiram propriedades particulares, tais como a resistência a certos antibióticos. O gene selectivo ampr codifica a enzima b -lactamase, que inactiva a amplicilina (antibiótico).

 

 

Figura 3- Microfotografia de plasmídeos.

 

 

Figura 4- Experiência típica de clonagem. Selecciona-se um plasmídeo adequado (vector) para a inserção de um gene determinado (DNA dador). Tanto o DNA dador como o vector têm sequências de DNA específicas (4 - 6 pares de bases) nas quais endonucleases de restrição cortam as cadeias do DNA. Em tubos separados, mistura-se por um lado o fragmento de DNA contendo o gene a ser clonado e por outro o plasmídeo no qual o gene será inserido, com a endonuclease de restrição escolhida (neste caso, EcoRl). A enzima escolhida deverá cortar o plasmídeo num só local. O plasmídeo cortado pode então receber uma porção adicional de DNA. Incuba-se os fragmentos de DNA e os plasmídeos cortados e abertos, com a enzima ligase que liga fragmentos de DNA e plasmídeos. Desta ligação resulta um plasmídeo recombinante que contém o fragmento de DNA desejado. As células que adquiriram os plasmídeos dizem-se «transformadas» e, neste caso, são resistentes ao antibiótico amplicilina.

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Quadro II - Componentes de uma experiência de clonagem.

Componente de clonagem

Função

DNA dador

Fonte do DNA ou gene a ser clonado

Endonuclease de restrição

Enzima utilizada para cortar tanto u DNA do dador como o do vector em locais específicos, de modo a que o DNA do dador possa ser inserido no vector

Vector

Plasmídeo ou bacteriófago utilizado para introduzir o gene a ser clonado numa célula hospedeira

Ligase de DNA

Enzima utilizada para ligar as extremidades livres e adaptáveis do DNA do vector e do dador e assim formar um vector recombinante

Célula hospedeira

Geralmente uma bactéria ou uma célula de levedura. Os vectores recombinantes introduzem -se nas células hospedeiras de modo a obter maiores quantidades da molécula de DNA recombinante

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O que é um vector?

Um vector é uma molécula de DNA à qual DNA estranho pode ser ligado e posteriormente inserido nas células de modo a que o DNA «recombinante» se possa replicar. Os vectores podem ser introduzidos nas células hospedeiras por transformação ou por infecção fágica

Existem vários tipos de vectores utilizados nas experiências de clonagem. Contudo, os mais frequentes são os plasmídeos e vírus bacteríanos (bacteriófagos) porque facilmente se introduzem nas células e são manipulados no laboratório. independentemente do tipo, os vectores têm de ter certas características adequadas à clonagem.

 

 

Quadro III - Características dos vectores de clonagem.

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CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Que atributos deverão ter as células hospedeiras destinadas à engenharia genética?

 

Algumas estirpes bacterianas e de levedura foram propositadamente desenvolvidas para as experiências de DNA recombinante. A muitas destas células hospedeiras corresponde um grupo de vectores que tem de ser utilizado de forma a clonar um gene com sucesso. Isto porque nem todos os vectores de clonagem têm a mesma origem de replicação (ori). Para que um dado plasmídeo se replique nas células, estas têm de reconhecer o seu local ori e aí recomeçar a replicação do DNA. Por razões de segurança, as células hospedeiras não se devem reproduzir na natureza, o que reduz a probabilidade de infecções acidentais de pessoas que trabalham nos laboratórios e da população em geral. Além do mais, tem de se evitar a transferência do DNA de uma célula hospedeira para outra, de modo a impedir a disseminação do DNA recombinante nas populações naturais dos organismos.

 

Nas noites quentes do Sul, podem observar-se pequenos pontos de luz emitida pelo abdómen dos pirilampos (Photinus pyralis). Esta luz produz-se através da reacção química catalisada pela enzima luciferase na presença de oxigénio, ATP e uma substância chamada «luciferina». O gene da luciferase (luc) tem sido um dos utensílios experimentais para determinar se um gene foi introduzido nas plantas. O produto génico da luciferase actua como repórter para indicar quando é que os genes estão activos nas plantas, porque quando o estão a planta emite luz. Em biologia do desenvolvimento acredita-se que se pode utilizar o gene da luciferase para estudar quando é que os genes estão activos ou inactivos durante o desenvolvimento de um organismo. Além disso, a luciferase é amplamente utilizada em química clínica e em ensaios bioquímicos de laboratórios de microbiologia.

Até há pouco tempo, a única fonte de luciferase eram os extractos dos abdómens dos pirilampos. O processo de extracção era fastidioso e a reserva de pirilampos muitas vezes imprevisível. Um grupo de cientistas da Universidade da Califórnia, em San Diogo, isolou o RNAm que codifica a luciferase do pirilampo, converteu-o em DNA e clonou-o num plasmídeo de E. coli. Os passos envolvidos no isolamento e na clonagem do gene da luciferase do pirilampo estão representados na Fig. 4. Também se introduziu em plantas um gene funcional da luciferase do pirilampo. As células da planta expressam o gene da luciferase e a planta brilha no escuro quando se fornece luciferina, ATP e oxigénio. Este tipo de experiência usa-se para aferir os processos de introdução de genes úteis em cereais, como por exemplo os genes responsáveis pela fixação do azoto ou os que lhes conferem resistência a herbicidas.

 

Figura 5- Clonagem do gene da luciferase (luc) em Escherichia coli.

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Figura 6- Microfotografia de E. Coli.

 

As moléculas de DNA recombinante podem ser construídas "in vitro", e pode-se isolar uma sequência desejada. Existem três procedimentos para obter essa sequência desejada:

 

  1. As moléculas recombinantes individuais devem estar fisicamente separadas uma da outra.
  2. As sequências recombinantes devem ser amplificadas para permitir material suficiente para futuras análises.
  3. fragmento especifico de interesse deve ser seleccionado por algum método que permita obter as sequências pretendidas.

 

Em algumas experiências, centenas ou milhares de fragmentos diferentes de DNA devem ser produzidos, e o isolamento de uma sequência particular deve parecer ser quase uma tarefa impossível.

O Hospedeiro é um sistema vivo estável, no qual o vector pode ser propagado.

O vector é o mensageiro do gene a clonar.

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Tipos de células hospedeiras

O tipo de células hospedeiras usadas para uma aplicação particular deve depender principalmente do objectivo das experiências de clonagem. Se o objectivo é isolar um gene para uma análise estrutural, é mais indicado um sistema simples que seja fácil de usar. Se o objectivo é expressar a informação genética em grandes eucariontes como as plantas, um sistema mais específico deve ser recomendado. Estes dois objectivos não são necessariamente mutuamente exclusivos. Frequentemente um simples Hospedeiro primário é usado para isolar a sequência que é depois introduzida dentro de um sistema mais complexo para expressão. Os principais tipos de hospedeiros estão representados no Quadro V.

 

Quadro V- Tipos de células hospedeiras usadas para engenharia genética

Grupo

Procariótica / Eucariótica

Tipo

exemplos

Bactéria

Procariótica

Gram -

Gram +

Escherichia coli

Baccilus subtilis

Streptomyces spp

Fungos

Eucariótica

Unicelulares

Multicelular

Saccharomyces cerevisiae

Aspergillus nidulans

Plantas

Eucariótica

Plastos

Células inteiras

Todo o organismo

Vários tipos

Vários tipos

Vários tipos

Animais

Eucarióticas

Células inteiras

Células de mamíferos

Oocitos

Todo o organismo

Drosophila melanogaster

Vários tipos

Vários tipos

Vários tipos

Nota : As células de animais e plantas devem ser sujeitas a manipulação em meios de cultura ou devem ser células de um organismo inteiro. Em alguns casos as células nos meios de cultura devem ser formadas por hibridação , a partir de células de diferentes espécies.

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Hospedeiros procarióticos

Uma célula hospedeira ideal deve ser fácil de manipular e propagar, deve estar disponível , com uma grande quantidade de cadeias geneticamente definidas. A bactéria Escherichia coli preenche estes requisitos, e é usada em muitos protocolos de clonagem.

A Escherichia coli tem sido estudada com grande detalhe, e muitas cadeias diferentes foram isoladas pelos geneticistas microbianos, durante a investigação dos mecanismos genéticos nos organismos procariontes. Estes estudos forneceram a informação básica essencial nos quais a engenharia genética é baseada.

A Escherichia coli é uma bactéria Gram- com um único cromossoma enrugado numa estrutura designada nucleótido. O tamanho do genótipo é 4X10 pares de bases.

processo da expressão génica (transcrição e tradução) está ligada, com a síntese novamente de RNAm ficando imediatamente disponível para a tradução.

Não há maturação do RNAm como acontece nas células eucarióticas. A Escherichia coli pode ser considerada como única, como a mais simples célula hospedeira.

Muitos dos genes clonados que são levados para fora e usados na rotina que o laboratório envolve. Os hospedeiros Escherichia coli com muitas cadeias geneticamente diferentes estão disponíveis para aplicações específicas.

A acrescentar à Escherichia coli, outra bactéria pode ser usada em experiências de clonagem de genes, como por exemplo, espécies de Bacillus, Pseudomonas e Streptomices. Há ,contudo, algumas desvantagens nesta células. Frequentemente há poucos vectores apropriados para utilizar em cada célula e obter DNA recombinante dentro da célula pode causar problemas.

Frequentemente faz-se uma clonagem inicial na Escherichia coli , isola-se a sequência pretendida, e depois introduz-se o DNA puro dentro do nucleótido do hospedeiro. Muitas das desvantagens podem ser evitadas usando esta aproximação, particularmente quando são usados os vectores fechados .

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Hospedeiros eucarióticos

Uma desvantagem de usar um organismo como a Escherichia coli como hospedeiro de clonagem, é que pertence a uma célula procariótica, e portanto falta a membrana nuclear (e outros organelos) que se encontram nas células eucarióticas. Isto significa que alguns genes eucarióticos não funcionam em Escherichia coli, onde não estão no seu ambiente normal, os quais podem enganar o seu isolamento por selecção de mecanismos que dependem da expressão do gene.

Também, se a produção da proteína eucariótica pretende um resultado desejável em experiências de clonagem, não deve ser fácil assegurar que um hospedeiro procariótico produza a totalidade das proteínas funcionais.

Os eucariontes superiores apresentam um tipo diferente de problemas para a engenharia genética, muitos dos quais requerem soluções especializadas. Frequentemente o objectivo das experiências de clonagem numa planta superior ou animal é para alterar as características genéticas do organismo, de isolar um gene para análises seguintes ou para produzir grandes quantidades de uma proteína particular.

A levedura Saccharomyces cerevisae é o ser unicelular eucariótico favorito para a engenharia genética. Tem sido usado à séculos Na produção da cerveja, do pão e tem sido muito estudado.

organismo é tratado com as clássicas análises genéticas, e a taxa de mutação das células é avaliada. Nos termos da complexidade do genoma, Saccharomyces cerevisae tem cerca de 2x107 pares de bases contido em 17cromossomas lineares (3,5 vezes mais que a Escherichia coli), e algumas estirpes possuem um tipo de plasmídeo conhecido como 2m . Este plasmídeo tem 6318 pares de bases e o seu número de cópias por célula é de aproximadamente 50.

Outros fungos podem ser usados em experiências de clonagem de genes, incluindo Aspergillus nidulans e Neurospora crassa.

As células animais e vegetais podem também ser usadas como hospedeiros para experiências de manipulação génica.

Algas unicelulares, Clamidomonas reinhardtir tem todas as vantagens dos microrganismos pela sua estrutura e função de células vegetais, e o seu uso em manipulações génicas cresce à medida que é mais estudada.

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BIBLIOGRAFIA

 

NICHOLL, Desmond S. T. (1994) - An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge University Press, United Kingdom.

 

STANSFIELD, William D., COLOMÉ, Jaime S. e CANO, Raúl (1998) - Biologia Molecular e Celular, McGraw-Hill.

 

LODISH, Harvey, BALTIMORE, David, BERK, Arnold, ZIPURSKY, S. Lawrence, MATSUDAIRA, Paul e DARNELL, James (1998) - Molecular Cell Biology, 3ª edição, Scientific American Books, United States of America.

 

PURVES, William K., ORIANS, Gordon H., HELLER, H. Craig e SADAVA, David (1997) - Life - The Science of Biology, 5ª edição, Sinauer Associates, Massachusetts U.S.A.

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Junho, 2000

Música de Fernando de Brito Vintém