[Universidade de Evora] UNIVERSIDADE DE ÉVORA
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Engenharia Genética - Clonagem de DNAs em Bactérias (Módulo I)
ACÇÃO FOCO - 1999
Docente Responsável:
Prof. Carlos Sinogas


PROPOSTA DE ACTIVIDADES EXPERIMENTAIS PARA
EXTRACÇÃO DE DNA DESTINADA A ALUNOS DO ENSINO SECUNDÁRIO

CRISTINA OLIVA
MARIA ILDA SERRANO


SUMÁRIO

Resumo

Protocolos Experimentais - Versão do Professor

Introdução

Preparação da actividade laboratorial

Procedimentos

Protocolos Experimentais - Versão do Aluno

Introdução

Objectivo

Procedimentos

EXTRAÇÃO de DNA de CÉLULAS DO EPITÉLIO BUCAL

Materiais

Procedimento

Tópicos para discussão

1. Quais são as estruturas celulares e qual a sua composição?

2. Onde se encontra o DNA na célula?

3. Qual a função dos reagentes usados na experiência?

4 - Quais as semelhanças e as diferenças entre o DNA de origem animal e o de origem vegetal?

5 - O DNA das ervilhas está morto?

6 - Porque encontramos um teor muito elevado de proteínas nas ervilhas e não tão elevado na cebola e no fígado?

7 - Como se justifica a grande quantidade de DNA extraído do timo?

8 - Porque motivo não se pode ver a dupla hélice que constitui a molécula de DNA?

Este trabalho destina-se à avaliação solicitada no âmbito da Acção de Formação

" Engenharia Genética - Clonagem de DNA em bactérias ( Módulo I ) - Foco 99 "

Como professoras do ensino secundário, constatámos que os programas das disciplinas que integram o Departamento de Ciências da Terra e da Vida apenas afloram este tema de forma teórica muito superficial verificando-se uma total ausência de qualquer actividade laboratorial. Decidimos então elaborar protocolos experimentais simples e acessíveis, possíveis de realizar nas condições reais das nossas escolas secundárias.

A nossa proposta de trabalho é uma adaptação de uma publicação do Utah Museum of Natural History, USA.

 

Resumo

O título da actividade - Extracção de DNA com "Química de Cozinha", sugere uma actividade prática simples, a partir de produtos e materiais comuns no dia a dia e que podem ser facilmente encontrados nas nossas cozinhas, de modo que os alunos possam repetir os protocolos em casa.

O trabalho experimental que propomos, permite uma introdução à genética laboratorial, que tem como principais objectivos:

  • Mostrar o aspecto do DNA
  • Mostrar que o DNA pode ser encontrado em todos os tipos de células
  • Debater e aprofundar questões científicas relacionadas com genética laboratorial.

Esta proposta de trabalho experimental está dividida em duas partes principais que consistem em protocolos experimentais - versão do professor e versão do aluno.

Os protocolos servem para orientar professor e alunos na extracção do DNA a partir de células de tecidos animais e vegetais, como por exemplo fígado, timo, células do epitélio bucal, cebolas e ervilhas.

As substâncias utilizadas podem ser facilmente adquiridas e o trabalho experimental pode ser feito num período de apenas 40 minutos.

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Protocolos experimentais

 

Protocolos Experimentais - Versão do Professor

Introdução

As experiências de extracção de DNA podem ser utilizadas como suplemento de outras actividades na sala de aula.

 

Utiliza-se a extracção laboratorial de DNA como :

 uma actividade para introduzir o tema da Constituição da Célula

 uma ferramenta de avaliação para medir o conhecimento do aluno no final da unidade da constituição da célula.

 Uma ponte conceptual entre o estudo da Constituição da Célula e o estudo da Genética.

 

Para a realização desta actividade os alunos devem possuir os seguintes pré-requisitos:

Teoria celular - organização da célula e função dos organitos celulares.

Devem conhecer :

 constituição das membranas celulares

 função das membranas celulares

 localização do DNA na célula

 estrutura das proteínas

 função estrutural e catalítica das proteínas.

Preparação da actividade laboratorial

Para que seja possível extrair DNA num período de 40 minutos é necessário que o professor prepare previamente alguns materiais. A primeira parte da experiência consiste na escolha do tecido a utilizar. Sugerimos a utilização de tecidos diferentes de modo que os alunos compreendam que o DNA pode ser encontrado em praticamente todos os tecidos, todas as células dos seres vivos.

Sugerimos que se use pelo menos um tecido animal e um tecido vegetal.

Os tecidos mais apropriados são o timo, o fígado ( de vitela, de porco ou galinha ), ervilhas secas, cebolas e leveduras ( fermento de padeiro ) e também células do epitélio bucal.

Dos tecidos sugeridos, o timo, apesar de ser o mais difícil de adquirir, é o melhor tecido a utilizar porque as células de timo proporcionam grandes quantidades de DNA. A utilização de células do epitélio bucal proporciona uma actividade prática muito simples, rápida e eficaz, uma vez que permite a visualização do DNA sem a necessidade de recorrer a diversos procedimentos. Recomendamos a utilização destas células por permitir aos alunos observar o seu próprio DNA. O procedimento para a utilização destas células está especificado no final do protocolo dos alunos.

Relativamente aos tecidos vegetais as cebolas produzem maior quantidade de DNA que as ervilhas, no entanto estas podem ser uma boa escolha, porque, mesmo que os alunos não isolem devidamente o DNA, constituem uma boa fonte de proteínas que aparecem como uma grande massa branca e viscosa.

 

Os procedimentos a seguir apresentados deverão ser experimentados previamente para que o professor se familiarize com os procedimentos de modo a solucionar e/ou prever possíveis problemas. Por exemplo a quantidade de água utilizada na preparação das misturas de células, poderá ser diferente dependendo do tecido escolhido. Uma mistura demasiado diluída ou demasiado concentrada poderá dificultar a filtração e a separação do DNA, quando se acrescenta o isopropanol.

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Procedimentos

1º Passo

Preparação da mistura de células

 

Materiais necessários

 Um copo misturador ou uma varinha mágica

 Gobelés de vidro

 Tecidos animais e vegetais

 Tubos de ensaio

 Chávenas de chá

 Colheres de chá

 

Fonte de células

Água

Sal

Detergente líquido da loiça

Duas cebolas médias grosseiramente picadas

1/2 chávena

1 colher de chá

1/2 chávena

1/2 chávena de ervilhas secas *

1 e 1/2 chávena

3 colher de chá

1/2 chávena

Fígado (uma fatia)

1/2 chávena

1 colher de chá

1/2 chávena

Timo

1/2 chávena

1 colher de chá

1/2 chávena

* NOTA: se utilizar ervilhas secas deve demolhá-las previamente, pelo menos durante 4 horas. Escorra as ervilhas antes de as usar.

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Execução

 Dissolver o sal na água.

 Colocar o tecido escolhido no misturador ou no copo da varinha mágica. Deitar água salgada suficiente para cobrir o tecido.

 Misturar até obter a consistência de um puré.

Não liquefazer totalmente as cebolas, poderão ficar pequenos fragmentos.

 Transferir a mistura para um gobelé.

 Adicionar cerca de 1/4 do detergente a cada gobelé. Misturar.

Depois de misturar a solução os alunos devem reflectir sobre o papel do sal e do detergente.

Os alunos deverão, ainda, consultar figuras representativas das estruturas celulares, reflectindo sobre o tratamento que, nesta experiência, foi dado a cada uma dessas estruturas.

2º Passo

Materiais necessários

 Um filtro de café

 Um passador de rede

 Gobelés

 Tubos de ensaio

Execução

 Colocar o filtro de café no passador de rede. Filtrar a mistura preparada no passo 1.

Se usar fígado como fonte de DNA, a mistura será demasiado viscosa para atravessar o filtro. Neste caso utilize apenas o passador de rede.

 Colocar o filtrado em cada um dos tubos de ensaio até à primeira linha

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3ª Passo

Materiais necessários

 Isopropanol à temperatura ambiente

 Palitos

Execução

 Adicionar, com cuidado, isopropanol, aos tubos de ensaio até à segunda linha.

 Observar com atenção

Depois de adicionar o isopropanol a camada de DNA vem ao de cima separando-se da camada inferior aquosa. O DNA surgirá com o aspecto de pequenos fios que sobem na camada de isopropanol, acompanhado de algumas bolhas.

Para olhos inexperientes será difícil ver o DNA, pelo que se deve encorajar os alunos a repetir a experiência com diferentes tecidos.

 Suavemente, rodar o palito dentro do tubo para retirar as frágeis películas

 Se o DNA for demasiado líquido para ser retirado com o palito tente com uma pipeta.

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Protocolos Experimentais - Versão do Aluno

 

" Á procura do DNA na cozinha "

 

Introdução

Toda a informação necessária para criar um organismo encontra-se no DNA. Esta molécula é usada durante o período de vida de um organismo para fornecer instruções para milhões de processos celulares que ocorrem constantemente.

Para estudar o modo como essas informações são comunicadas à célula os cientista isolaram o DNA e estudaram o modo de interacção do DNA com as proteínas e RNAs.

Este trabalho laboratorial usa um processo semelhante ao utilizado pelos cientistas quando começaram as primeiras investigações sobre DNA.

Para isolar o DNA os cientista separaram-no dos outros componentes celulares. As células foram fragmentadas e o DNA separado do conteúdo lipídico das membranas da célula e dos organitos. Em seguida o DNA foi separado das proteínas.

 

Parece muito complicado, no entanto não é. De facto pode-se realizar um procedimento para extracção de DNA com coisas comuns na tua cozinha.. Vais observar em 40 minutos aquilo que os cientistas levaram muitos anos a descobrir, embora nesta actividade se utilizem procedimentos e instrumentos muito simples que não permitindo a separação do DNA de proteínas e de RNA, possibilita a visualização do conteúdo nuclear, sob a forma de filamentos brancos.

Nesta actividade vais usar diferentes tecidos e ficarás apto a observar DNA de várias origens, uma vez que todas as células contêm DNA ao longo do seu período de vida. Algumas células, tais como, os glóbulos vermelhos perdem o núcleo, bem como o DNA durante a sua maturação.

 

Objectivo

Isolar DNA de células.

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Procedimentos

1º Passo

Materiais

 Copo com mistura de células e água salgada.

 Varinha mágica ou copo misturador

Execução

 Identifica na tua bancada o gobelé que contem a mistura celular obtida dos tecidos utilizados, aos quais foi acrescentada água salgada e o detergente.

 Agita suavemente a mistura por 5 ou 10 minutos.

 Utilizando a bibliografia à tua disposição no laboratório, procura esquemas elucidativos sobre a composição das estruturas celulares e reflecte sobre o modo como elas são afectadas ao longo da experiência.

2º Passo

Materiais

 Um filtro de café

 Um passador de rede

 Gobelés

 Tubos de ensaio

Execução

 Colocar o filtro de café no passador de rede. Filtrar a mistura preparada no passo 1.

Se usar fígado como fonte de DNA, a mistura será demasiado viscosa para atravessar o filtro. Neste caso utilize apenas o passador de rede.

 Colocar o filtrado em cada um dos tubos de ensaio até à primeira linha

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3º Passo

 Adicionar, com cuidado, o isopropanol ao conteúdo dos tubos de ensaio (fig.1) até à segunda linha.

Fig.1

 

o isopropanol formará uma camada por cima da mistura de células. O DNA é menos denso que a mistura de células mas mais denso que o álcool, e assim, no início, ficará no meio onde as duas camadas se encontram, na interface água/álcool (Fig.2).

Já que o DNA não se pode dissolver no álcool, na concentração aqui utilizada, começará a separar-se da solução aquosa elevando-se na camada de álcool.

Fig.2

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Começará a observar o DNA, que terá um aspecto translúcido ou esbranquiçado. O aparecimento de pequenas bolhas (Fig.3a e 3b) junto às cadeias de DNA ajudar-te-á a reconhece-lo.

O DNA move-se lentamente no álcool, formando pequenos filamentos (Fig.4a e 4b).

Fig. 3a

Fig. 3b

PARABÉNS !

EXTRAÍSTE O DNA DAS CÉLULAS !

Fig.4a

Fig.4b

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EXTRAÇÃO de DNA de CÉLULAS DO EPITÉLIO BUCAL

Materiais

 Gobelés

 Funil

 Papel de filtro

 Água

 Sal

 Isopropanol

 Palitos

Procedimento

 Preparar uma solução salina muito concentrada.

 Colocar uma porção dessa solução salina na boca e bochechar vigorosamente durante 2 minutos.

 Colocar o obtido em 2 num gobelé e filtrar em seguida.

 Marcar duas linhas num tubo de ensaio, uma ao meio do tubo e outra perto do bordo.

 Transferir o filtrado para um tubo de ensaio até à primeira linha.

 Adicionar, cuidadosamente, isopropanol até à segunda linha

 Observar com atenção e registar.

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Tópicos para discussão

1. Quais são as estruturas celulares e qual a sua composição?

As membranas, celular e nuclear são compostas principalmente por lípidos. As proteínas encontram-se aprisionadas na bicamada lipídica.

Os organitos celulares são compostos por proteínas, ácidos nucleicos ( DNA e RNA ), envolvidos por uma membrana.

As paredes celulares das células vegetais são compostas essencialmente por polissacarídeos.

As pequenas estruturas celulares são compostas por substâncias com diferentes propriedades químicas, pelo que os procedimentos experimentais devem ser definidos de modo a separar um determinado constituinte celular das restantes partes, sem causar muitos danos.

2. Onde se encontra o DNA na célula?

Cerca de 99% do DNA encontra-se no núcleo da célula. O restante DNA encontra-se em locais específicos, como por exemplo organitos ( as mitocôndria e os cloroplastos possuem o seu próprio DNA ). Apesar desses organitos terem o seu próprio cromossoma eles não podem contar com a sua informação. As mitocôndrias e cloroplastos necessitam de genes especiais situados noutros organitos. Para a maioria das funções, estes organitos utilizam os cromossomas nucleares.

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3. Qual a função dos reagentes usados na experiência?

3.1. Sal?

A adição do sal (NaCl) no início da experiência proporciona ao DNA um ambiente favorável. O sal contribui com iões positivos que neutralizam a carga negativa do DNA. Numerosas moléculas de DNA podem coexistir nessa solução.

3.2. Detergente?

O detergente afecta as membranas porque elas são constituídas por lípidos. Com a rotura das membranas o conteúdo celular, incluindo as proteínas e o DNA, soltam-se e dispersam-se na solução. A função de algumas dessas proteínas é manter o DNA enrolado numa espiral muito apertada

3.3. Álcool?

O DNA não se dissolve no álcool, na concentração que usamos na nossa experiência. Como resultado, o DNA aparece à superfície da solução ou precipita. O DNA é menos denso que a água e a mistura aquosa dos restos celulares. Assim na nossa experiência ele surge à superfície da solução aquosa.

4 - Quais as semelhanças e as diferenças entre o DNA de origem animal e o de origem vegetal?

Todas as células de um organismo possuem a mesma colecção de cromossomas. Os cromossomas são ainda idênticos em todos os indivíduos de uma determinada espécie, ou seja a informação estrutural e funcional é essencialmente a mesma em todos os indivíduos. No entanto, existem pequenas diferenças no DNA de cada indivíduo de uma espécie. São estas pequenas diferenças ( mas não necessariamente ) que tornam distintas as habilidades de cada indivíduo para uma determinada função. O DNA é, por exemplo determinante na identificação de uma pessoa e muito utilizado para identificar indivíduos acusados criminalmente.

 

O DNA extraído das ervilhas não é todo igual, porque cada semente de ervilha pode derivar ( mesmo sendo da mesma planta ) de uma fecundação cruzada. Para além disso, cada ervilha tem cromossomas ligeiramente diferentes.

 

Em contraste, se a mistura de cebola cortada foi obtida de uma única cebola, o DNA recolhido será composto por várias réplicas dos mesmos cromossomas.

 

Do mesmo modo, se o fígado tiver origem no mesmo indivíduo, o DNA recolhido representa uma única colecção de cromossomas

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5 - O DNA das ervilhas está morto?

O DNA é uma molécula, não está vivo ou morto.

 

Dos tecidos que usamos nesta experiência, só as ervilhas e o fermento de padeiro ( leveduras ), se os escolherem são vivos. Se não acreditam que as ervilhas continuam vivas tentem faze-las germinar.

Apesar de parecerem mortas, estão apenas num estado de dormência.

Os outros tecidos usados para extrair DNA ( cebola, fígado e células do epitélio bucal ) só estão vivos quando fazem parte da planta viva ou do animal.

 

Como é que se pode extrair DNA de qualquer coisa morta?

O DNA é uma das moléculas mais estáveis que existem nas células. O DNA pode ser extraído praticamente intacto de ossos fossilizados, de sangue seco ou de um simples cabelo.

6 - Porque encontramos um teor muito elevado de proteínas nas ervilhas e não tão elevado na cebola e no fígado?

As ervilhas são sementes. Os tecidos de reserva das sementes fornecem energia e nutrientes para o crescimento do embrião, enquanto este abre caminho através do solo, até à luz do Sol, e se possa tornar fotossintético.

 

Os lípidos armazenados na semente são usados pelo embrião como fonte de energia ( nós usamos glícidos armazenados nas raízes ou nos frutos das plantas como fonte energética). As proteínas armazenadas nas sementes asseguram também a nutrição da nova planta. À medida que a planta cresce, algumas proteínas são destruídas e as suas unidades estruturais ( aminoácidos) são reutilizadas para sintetizar novas proteínas que a planta embrionária necessita para o seu crescimento.

7 - Como se justifica a grande quantidade de DNA extraído do timo?

O timo é uma glândula, constituída por pequenas células ( linfócitos muito pequenos ) onde o núcleo ocupa quase todo o espaço celular. Assim o material nuclear ( cromossomas ), é mais abundante que o restante material celular. Na mesma unidade de massa há mais células em relação aos outros tecidos utilizados.

8 - Porque motivo não se pode ver a dupla hélice que constitui a molécula de DNA?

A dupla hélice da cada molécula de DNA é demasiado pequena para se observar. Apesar de o DNA ser a maior molécula na célula, só pode ser visto com um microscópio electrónico. A razão pela qual podemos observar o DNA na nossa experiência é que temos milhões de cadeias de DNA e RNA aglomerados, para além de imensas proteínas.

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Junho, 2000

Música de Fernando de Brito Vintém