CIM, Revista da Ordem dos Farmacêuticos 1998 25: 1-4 (1998)

Medicamentos de Biotecnologia.

Carlos Sinogas

Ainda não há muito tempo, todos nos lembramos que os diabéticos utilizavam insulina porcina, preparada de pâncreas animal. Sendo uma proteína heteróloga, apesar de relativamente pequena, era susceptível de provocar reacções imunitárias de rejeição pelo organismo a que era administrada, com a consequente perda de eficácia. A alternativa mais lógica, seria, naturalmente, a preparação da insulina a partir de dadores humanos, como ainda hoje acontece para outro tipo de produtos. Como se imagina, a quantidade de insulina possível de preparar a partir de pâncreas humano seria irrelevante face ao universo de diabéticos que dela precisam. Acrescentar-se-ia a esta limitação, a questão relativa à segurança microbiológica do produto obtido.

As metodologias biotecnológicas permitem que, nos dias que correm, a insulina disponível para uso pela maior parte dos diabéticos que dela necessitam seja insulina humana, obtida por recombinação artificial do DNA. É a chamada insulina recombinante.

Em linhas gerais, um gene da insulina extraído de células humanas foi clonado em bactérias, manipulado de forma a permitir a expressão de um polipéptido idêntico ao que existe naturalmente no homem, e serve de molde para a produção industrial de uma proteína feita pela bactéria, mas em tudo igual à que o homem faz no seu pâncreas. Porque o código genético é universal e os mecanismos da expressão genética necessários à síntese desta proteína são idênticos nos eucariotas e procariotas, obtém-se uma insulina recombinante não distinguível da molécula humana.

Enquadramento regulamentar

Para efeitos legais são considerados de biotecnologia os medicamentos obtidos por "Tecnologia de DNA recombinante" ou por "Expressão controlada de genes que codificam proteínas biologicamente activas em procariotas e eucariotas, incluindo células transformadas de mamíferos, métodos com hibridomas e anticorpos monoclonais" (Estatuto do Medicamento).

A autorização para a sua introdução no mercado compete à União Europeia e é subsequente a opinião favorável emitida pelo Comité das Especialidades Farmacêuticas (CPMP) da Agência Europeia do Medicamento (EMEA): é o processo centralizado.

Para a emissão de uma opinião final sobre um processo centralizado, os peritos da EMEA avaliam a documentação submetida pela empresa requerente, de acordo com as linhas de orientação do CPMP ("guidelines") que relevam para o tipo de medicamento em causa. Algumas destas guidelines têm um âmbito mais alargado que a União Europeia, resultam de consensos regionais que incluem também o Japão e os Estados Unidos (ICH - "International Conference on Harmonisation").

As guidelines a que nos referimos neste texto, assim como os relatórios públicos da avaliação dos processos centralizados (EPAR) podem ser consultadas na Internet, nas páginas da EMEA (http://www2.eudra.org/humandocs/humans/ICH.htm).

Qualidade Farmacêutica

Duma perspectiva farmacêutica, o que estes medicamentos têm de diferente que justifica um tratamento regulamentar específico é o facto de as suas substâncias activas resultarem directamente da actividade metabólica de seres vivos. Existe a potencialidade de uma variabilidade biológica, intrínseca de tudo quanto vive, e um risco de contaminação microbiológica. Porque é de macromoléculas orgânicas que se trata, a sua extracção e purificação não podem, em regra, ser muito drásticas.

Neste contexto a garantia de qualidade dos chamados medicamentos biotecnológicos assenta em controlos analíticos muito apertados, que vão muito para além do processo de fabrico, incluindo também aspectos relevantes da obtenção da matéria prima, e a reverificação das especificações dos produtos finais e intermediários, lote a lote, pelas autoridades sanitárias.

Para a garantia da consistência na produção de medicamentos de biotecnologia, os aspectos principais que é preciso ter em conta relacionam-se com a célula transformada ou transfectada para a expressão e com a construção nucleotídica que a dirige. A segurança microbiológica, principalmente relativa a potenciais contaminantes virais, é garantida pelos procedimentos adoptados na obtenção das células recombinantes e dos produtos e pela aplicação de metodologias com demonstrada capacidade para remover contaminantes virais, na eventualidade de uma infecção adventícia.

Substratos celulares (1)

Para a obtenção de um produto adequadamente consistente, é recomendada a constituição de bancos de células. Estas células deverão ser todas iguais, por forma a permitir que o processo de produção seja conduzido à obtenção de um produto de características constantes.

A história completa da linha celular, desde o seu isolamento da célula inicial e que inclua todos os passos de modificação que sofreu, como passagens em animal, hibridação com outras células, infecções ou transfecções virais, por exemplo, são aspectos relevantes para a avaliação das propriedades a testar ou riscos potenciais a prevenir no sentido de garantir uma adequada qualidade e segurança do produto obtido a partir dessa linha celular.

Há ainda que considerar o animal donde foi preparada a célula inicial, sua origem ou etnia, estado se saúde, sexo, idade, tipo do tecido, etc., e a descrição pormenorizada de todos os processos por que passou e que são susceptíveis de introduzir agentes infecciosos. Os resultados dos testes aos marcadores virais relevantes para a situação deverão ser submetidos numa perspectiva de qualificação do banco de células a utilizar na produção industrial.

É também recomendada a adopção de uma estratégia de utilização de dois bancos subsequentes na produção: um banco de células primário (MCB "Master Cell Bank") e um banco de células de trabalho (WCB "Working Cell Bank"), por forma a que as células obtidas possam assegurar um tempo de utilização suficientemente alargado relativamente à vida útil prevista para o produto.

O MCB deverá ser exaustivamente caracterizado, nomeadamente no que se refere à eventual presença de outros tipos de células, agentes infecciosos endógenos ou adventícios e contaminantes moleculares (toxinas, p.ex.). O objectivo principal desta caracterização exaustiva pretende assegurar a identidade e pureza das células a utilizar na produção e a sua adequabilidade para o fim pretendido. Dependente do tipo de células, a avaliação da sua capacidade tumorigénica e determinação do cariotipo poderão ser exigíveis em diferentes fases da multiplicação celular. O conhecimento prévio do tipo de célula a usar e a extensão da sua caracterização condicionarão os testes a efectuar para caracterização dos WCB e os testes de rotina durante a produção. Entre os testes para qualificação das linhas celulares merecem realce especial:

1.- Os testes de identidade. A prova de que as células a utilizar são as descritas deverá ser inequivocamente produzida pelos resultados de testes laboratoriais adequados e dependente do tipo de célula. Estes testes poderão referir-se a características genotípicas ou fenotípicas. Um mais limitado número de testes é também elegível na constituição dos WCB e na produção industrial, para reverificação.

2.- Os testes de pureza. Um aspecto crítico que deverá ser tido em conta é o nível de pureza das células a usar. Porque o processo de produção implica a multiplicação das células, importa estabelecer uma adequada ausência de outros contaminantes celulares ou agentes virais. Também aqui os testes a realizar dependem do tipo de células a usar, da sua origem animal e dos agentes infecciosos susceptíveis de ser amplificados durante a cultura.

3.- A estabilidade celular. A caracterização do substrato celular terá de determinar a estabilidade das células durante o armazenamento dos bancos e durante os ciclos da manufactura, de forma a garantir uma produção consistente do produto pretendido, tanto em termos de qualidade como de quantidade. Dependente desta caracterização e doutros estudos preliminares será definido o número máximo de ciclos de multiplicação celular permitidos durante a produção industrial.

4.- Os testes de cariologia e tumorigenicidade. Para os produtos em que a ausência de células vivas ou níveis significativos de DNA não podem ser adequadamente garantidos pela purificação do produto, impõe-se a caracterização dos níveis de poliploidia e capacidade tumorigénica das células durante e para além da sua vida útil de produção. A realização destes testes e respectiva amplitude depende também do tipo de célula e do conhecimento prévio que existe da mesma para condições de produção análogas.

 

Culturas primárias

Dado que alguns produtos, nomeadamente algumas vacinas são produzidas em células directa e imediatamente obtidas do tecido, sem a constituição de bancos celulares, não é possível proceder a uma completa caracterização. Além disso e em geral, os produtos obtidos por cultura de células primárias não são alvo de purificação extensiva. A garantia de qualidade e segurança dos produtos obtidos deste tipo de linhas celulares deverá ser demonstrada pela informação relativa às especificações definidas para a origem do tecido e outros elementos relativos às matérias primas utilizadas no estabelecimento dos substratos celulares, informação sobre a preparação dos substratos e testes para a sua qualificação. Particularmente relevantes são os testes demonstrativos da ausência de agentes infecciosos adventícios. Estes testes são efectuados por inoculação dos substratos celulares e sobrenadantes dos meios de cultura noutras células adequadas. A observação de eventuais efeitos citopáticos, a presença de agentes virais hemoadsorventes ou de retrovírus, dependente do tipo de célula usada e sua origem animal, condicionará a permissão para o uso clínico do produto. Para além da qualificação do substrato celular, é também exigível uma extensiva caracterização do produto final, devendo o produtor justificar de forma convincente a estratégia que escolheu para garantir a sua qualidade e segurança.

Construções nucleotídicas para expressão (2)

A análise do DNA e da proteína recombinante pretendem demonstrar a adequabilidade da construção efectuada e do sistema de expressão utilizado. Impõe-se garantir a identidade da substância activa, a consistência da sua produção, e a adequada segurança viral do produto final.

A construção para expressão assim como o clone celular que a contem deverão ser analisados para caracterização das sequências introduzidas e da proteína recombinante a obter na produção industrial. Todos os passos para a construção do vector deverão ser descritos detalhadamente, com inclusão da origem e funções pretendidas das sequências usadas (promotores, operadores, "enhancers", ORF, etc.). Deverá ser elaborado um mapa genético completo da construção, com indicação dos componentes e sua sequência nucleotídica, expressamente determinada ou retirada da bibliografia e suficientemente confirmada. Outras proteínas eventualmente expressas pela construção (resistência a antibióticos, por exemplo) deverão ser indicadas e convenientemente estudadas. A região codificante e as zonas de inserção desta deverão ser completamente sequenciadas na construção nucleotídica a utilizar na produção.

Para além da caracterização do banco de células transformadas e dos testes de rotina a efectuar para controlo do processo produtivo, impõe-se avaliar também as quantidades relativas de células na cultura que retêm a construção nucleotídica para expressão ou o número de cópias por célula, quando se trate de elementos genéticos extracromossomais.

O limite do número de gerações das células durante a produção industrial, deverá ser estabelecido com base em investigação prévia que assegure a adequabilidade das culturas, nos termos em que atrás se refere e também numa perspectiva de estabilidade da construção genética e sua persistência na cultura em quantidades adequadas para o fim em vista.

A caracterização nucleotídica do vector de expressão, assim como a caracterização da proteína recombinante expressa deverão ser tão completas quanto possível e quanto for razoavelmente justificado. Pretende-se a garantia de uma adequada qualidade farmacêutica do produto final, particularmente no que se refere à identidade, homogenidade e consistência de produção.

Segurança viral (3)

Alguns dos vectores utilizados para a expressão de proteínas recombinantes são agentes virais, que importa remover durante o processo de purificação do produto. Porque são produzidos por processos que passam por culturas de células, o fabrico dos medicamentos de biotecnologia é também susceptível de suportar o crescimento de agentes virais adventícios, adicionados ao sistema por contaminação dos reagentes utilizados. Apesar da extensiva caracterização das matérias primas iniciais (banco de células) e controlo das especificações das matérias primas, do produto final e de produtos intermediários, importa conhecer o processo de fabrico relativamente à sua capacidade para remover ou inactivar agentes virais. É necessária uma garantia suplementar de qualidade e segurança do produto final, no sentido de que na ocorrência de uma eventual infecção adventícia, não detectada pelos controlos "in process", não fique comprometida a utilização clínica a que o medicamento se destina.

Como se referiu atrás, os bancos de células, durante o seu estabelecimento, deverão ser testados de forma a garantir a ausência de agentes virais indesejados. Estes testes deverão ser efectuados não só nas células dos bancos como em condições de produção industrial, para além do número de duplicações celulares especificado. É particularmente importante proceder à pesquisa de vírus relevantes em função da origem da célula utilizada e da utilização clínica do produto. Para além doutros vírus patogénicos para o Homem é também necessária a realização de testes exaustivos para a detecção de retrovírus. Deverão ser utilizados testes de infecciosidade em outras linhas celulares diferentes, observação directa em microscópio electrónico e avaliação da actividade enzimática de transcriptase reversa. Importa também realizar ensaios in vivo em murganhos adultos e recém-nascidos e em ovos embrionados, bem como testar a indução de anticorpos específicos anti-virais em animais injectados com o produto em estudo. A realização sequencial de todos estes testes dependerá dos resultados negativos que forem sendo obtidos nos testes anteriores. Na hipótese da detecção da presença de um vírus não esperado, há que estudar a sua origem, só sendo admissível considerar situações em que a origem da contaminação seja bem determinada e seja possível evitar contaminação idêntica no futuro.

A detecção de um vírus não esperado numa linha celular inviabilizará, em princípio, a sua utilização como hospedeira do vector a exprimir a proteína recombinante para a produção industrial do medicamento.

Dependente dos resultados de qualificação do substrato celular e dos resultados obtidos com as células depois da expansão para além do limite previsto para a produção, definir-se-ão os testes anti-virais a realizar no produto a granel ou no produto final.

 

Testes de validação viral

Adicionalmente à não detecção de contaminantes virais endógenos do substrato celular, o processo de produção industrial deverá incluir passos para remover ou inactivar vírus inadvertidamente adicionados ao sistema ou cuja presença não possa ser evitada (vectores de expressão, por exemplo). Estes passos deverão ser estudados de forma a determinar a sua efectiva capacidade para reduzir de forma significativa a infecciosidade associada à presença desses vírus: é a chamada validação viral.

Para proceder à validação de qualquer técnica deste tipo será sempre necessário proceder à sua instalação laboratorial em condições experimentais tão próximas quanto possível da técnica incluída no processo industrial. No laboratório a técnica deverá ser executada com o mesmo material depois de adicionado de quantidades conhecidas de vírus a estudar. As cargas virais remanescentes, depois de executada a técnica em estudo, deverão se avaliadas e reconciliadas com a quantidade inicialmente introduzida no sistema. Se se tratar de um processo inactivador de vírus, será necessário estudar também a cinética dessa inactivação.

Os vírus a utilizar na validação viral destes processos, se não puderem ser os próprios, deverão possuir características físico-químicas semelhantes aos que forem relevantes para o processo industrial. Adicionalmente deverão também ser utilizados outros vírus com outras características físico-químicas que, no seu conjunto, possam representar o maior número possível de tipos de agentes virais diferentes. Pretende-se demonstrar a robustez do processo na eliminação ou inactivação de eventuais contaminações virais não previsíveis.

Os resultados obtidos deverão ser estatisticamente tratados para determinação dos coeficientes de remoção / inactivação, que se exprimem nos logaritmos das quantidades relativas de vírus inactivados ou removidos do sistema.

A avaliação e aceitabilidade dos resultados dos testes de remoção / inactivação viral dependerá da adequabilidade do ensaio, dos vírus escolhidos, do esquema de purificação, do nível de redução conseguido, dos efeitos potenciais no processo de purificação e dos limites de detecção e sensibilidade dos testes executados.

Nota final

Face ao quadro geral que aqui se esboça, em particular naquilo que se refere aos testes e verificações a efectuar em fase do desenvolvimento bio-farmacêutico e aos inúmeros controlos analíticos a efectuar nas múltiplas fases dos processos produtivos, o nível de qualidade que é garantido para os medicamentos de biotecnologia é muito elevado. Também o nível de segurança microbiológico, que é possível garantir para estes medicamentos, é significativamente mais elevado que o que se consegue para os chamados medicamentos biológicos, obtidos por extracção directa de tecidos animais. O mesmo se passa relativamente à consistência da produção. É possível a obtenção de produtos finais com menor variabilidade de lotes para lotes.

Do lado dos inconvenientes não se pode deixar de referir o elevado preço a que os medicamentos de biotecnologia são, em geral, comercializados. Estes preços serão parcialmente justificados pelos investimentos efectuados no desenvolvimento e pela extensão dos controlos analíticos durante a produção.

Também no campo da eficácia clínica, os medicamentos de biotecnologia serão menos vantajosos que os seus equivalentes de extracção a partir de tecidos humanos. A sua produção artificial, em células de cultura, não permite a selecção positiva das espécies moleculares da substância activa, como normalmente acontece durante a expressão no tecido original. Eventuais agregados, produtos de degradação ou moléculas com mutações ou estruturas terciárias anómalas, não sendo alvo dos mecanismos de correcção naturais, podem ultrapassar os controlos analíticos e subsistir no produto final. O aparecimento destes novos epitopos é susceptível de desencadear respostas imunitárias de rejeição com a consequente perda de eficácia clínica futura do medicamento.

 

(1) - Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Derivation and characterisation of cell substrates used for production of biotechnological / biological products (ICH, step 4). CPMP/ICH/294/95.

(2) - Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Analysis of the expression construct in cell lines used for production of r-DNA derived protein products (ICH, step 4). CPMP/ICH/139/95.

(3) - Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Viral safety evaluation of biotechnological products derived from cell lines of human and animal origin (ICH, step 4). CPMP/ICH/295/95.

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