Boletim Informativo da Associação Portuguesa dos Farmacêuticos Hospitalares 1999 21: 3-7

 

Medicamentos de Origem Biotecnológica - Qualidade e Segurança. Aspectos científicos a considerar.

 

Carlos Sinogas

A lei define medicamentos de biotecnologia como os que são obtidos por "Tecnologia de DNA recombinante" ou por "Expressão controlada de genes que codificam proteínas biologicamente activas em procariotas e eucariotas, incluindo células transformadas de mamíferos, métodos com hibridomas e anticorpos monoclonais" (Estatuto do Medicamento - decreto-lei n.º 72/91). A autorização para a sua introdução no mercado compete à União Europeia e é subsequente a opinião favorável emitida pelo Comité das Especialidades Farmacêuticas (CPMP) da Agência Europeia do Medicamento (EMEA): é o processo centralizado.

Para a emissão de uma opinião final sobre um processo centralizado, os peritos da EMEA avaliam a documentação submetida pela empresa requerente de acordo com as linhas de orientação do CPMP ("guidelines") que relevam para o medicamento em causa. Algumas destas "guidelines" têm um âmbito mais alargado que a União Europeia, resultam de consensos ao nível da ICH ("International Conference on Harmonisation"), também com o Japão e os Estados Unidos.

Quando se trata de medicamentos de origem biológica ou biotecnológica, as "guidelines" específicas aplicáveis são elaboradas num grupo científico especializado do CPMP: o Grupo de Trabalho de Biotecnologia ("Biotechnology Working Party" - BWP), de que o subscritor é membro permanente.

As áreas de intervenção a que o BWP é chamado, principalmente nos âmbitos da qualidade e segurança dos produtos, incluem, para além dos medicamentos de origem biotecnológica, os anticorpos monoclonais e medicamentos que os usem como reagentes na sua preparação, as vacinas e alergénios, aspectos relacionados com a terapêutica genética e os medicamentos derivados de plasma humano.

Nesta comunicação abordaremos apenas alguns aspectos de "guidelines" redigidas pelo BWP e que relevam para a avaliação da qualidade e segurança dos medicamentos de biotecnologia. Discutiremos pontos relacionados com a caracterização dos substratos celulares, análise da construção para expressão de DNA recombinante, avaliação da segurança viral, minimização do risco de transmissão de TSEs.

Os textos integrais destas "guidelines", tanto em aplicação como em fase de revisão, bem como de outras que aqui não trataremos, estão disponíveis para o público em geral através da Internet, nas páginas da EMEA (http://www.eudra.org/emea.html).

 

 

Substratos celulares (1)

Os conceitos e orientações previstos nesta guideline aplicam-se aos substratos celulares, previamente constituídos em banco e destinados ao fabrico de quaisquer produtos, com excepção de metabolitos microbianos não proteináceos. As células a considerar são de origem humana ou animal, em cultura contínua ou com um período de vida limitado em cultura.

A história completa da linha celular, desde o seu isolamento da célula inicial e que inclua todos os passos de modificação que sofreu, como passagens em animal, hibridação com outras células, infecções ou transfecções virais, por exemplo, são aspectos relevantes para a avaliação das propriedades a testar ou riscos potenciais a prevenir no sentido de garantir uma adequada qualidade e segurança do produto obtido a partir dessa linha celular.

Há ainda que considerar o animal donde foi preparada a célula inicial, sua origem ou etnia, estado se saúde, sexo, idade, tipo do tecido, etc., e a descrição pormenorizada de todos os processos por que passou e que são susceptíveis de introduzir agentes infecciosos. Os resultados dos testes aos marcadores virais relevantes para a situação deverão ser submetidos numa perspectiva de qualificação do banco de células a utilizar na produção industrial.

A constituição de banco de células, que é recomendada, deverá ser pormenorizadamente considerada. É preferível a adopção de uma estratégia de utilização de dois bancos subsequentes na produção: um banco de células primário (MCB – "Master Cell Bank") e um banco de células de trabalho (WCB – "Working Cell Bank").

O MCB deverá ser exaustivamente caracterizado, nomeadamente no que se refere à eventual presença de outros tipos de células, agentes infecciosos endógenos ou adventícios e contaminantes moleculares (como toxinas, por exemplo). O objectivo principal desta caracterização exaustiva pretende assegurar a identidade e pureza das células a utilizar na produção e a sua adequabilidade para o fim pretendido. Dependente do tipo de células, a avaliação da sua capacidade tumorigénica e determinação do cariotipo poderão ser exigíveis em diferentes fases da multiplicação celular. O conhecimento prévio do tipo de célula a usar e a extensão da sua caracterização condicionarão os testes a efectuar para caracterização dos WCB e os testes de rotina durante a produção. Entre os testes para qualificação das linhas celulares merecem realce especial:

1.- Os testes de identidade. A prova de que as células a utilizar são as descritas deverá ser inequivocamente produzida pelos resultados de testes laboratoriais adequados e dependente do tipo de célula. Estes testes poderão referir-se a características genotípicas ou fenotípicas. Um mais limitado número de testes é também elegível na constituição dos WCB e na produção industrial.

2.- Os testes de pureza. Um aspecto crítico que deverá ser tido em conta é o nível de pureza das células a usar. Porque o processo de produção implica a multiplicação das células, importa estabelecer uma adequada ausência de outros contaminantes celulares ou agentes virais. Também aqui os testes a realizar dependem do tipo de células a usar, da sua origem animal e dos agentes infecciosos susceptíveis de ser amplificados durante a cultura.

3.- A estabilidade celular. A caracterização do substrato celular terá de determinar a estabilidade das células durante o armazenamento dos bancos e durante os ciclos da manufactura, de forma a garantir uma produção consistente do produto pretendido, tanto em termos de qualidade como de quantidade. Dependente desta caracterização e doutros estudos preliminares será definido o número máximo de ciclos de multiplicação celular permitidos durante a produção industrial.

4.- Os testes de cariologia e tumorigenicidade. Para os produtos em que a ausência de células vivas ou níveis significativos de DNA não podem ser adequadamente garantidos pela purificação do produto, impõe-se a caracterização dos níveis de poliploidia e capacidade tumorigénica das células durante e para além da sua vida útil de produção das células. A realização destes testes e respectiva amplitude depende também do tipo de célula e do conhecimento prévio que existe da mesma para condições de produção análogas.

Dado que alguns produtos, nomeadamente algumas vacinas são produzidas em células directa e imediatamente obtidas do tecido, sem a constituição de bancos celulares, não é possível proceder a uma completa caracterização. Além disso e em geral, os produtos obtidos de células primárias não são alvo de purificação extensiva. A garantia de qualidade e segurança dos produtos obtidos de linhas celulares primárias deverá ser demonstrada pela informação relativa às especificações definidas para a origem do tecido e outros elementos relativos às matérias primas utilizadas no estabelecimento dos substratos celulares, informação sobre a preparação dos substratos e testes para a sua qualificação. Particularmente relevantes são os testes demonstrativos da ausência de agentes infecciosos adventícios. Estes testes são efectuados por inoculação dos substratos celulares e sobrenadantes dos meios de cultura noutras células adequadas. A observação de eventuais efeitos citopáticos, a presença de agentes virais hemo-adsorventes ou de retrovírus, dependente do tipo de célula usada e sua origem animal, condicionará a possibilidade do uso clínico do produto. Para além da qualificação do substrato celular, é também exigível uma extensiva caracterização do produto final, devendo o produtor justificar de forma convincente a estratégia que escolheu para garantir a sua qualidade e segurança.

Construções nucleotídicas para expressão (2)

As recomendações constantes desta guideline indicam os testes normalmente requeridos para identificação e caracterização da construção nucleotídica de cuja expressão nas culturas de produção resulta a proteína recombinante componente do medicamento.

A análise do DNA e da proteína recombinante pretendem que seja demonstrada a adequabilidade da construção efectuada e do sistema de expressão utilizado. Os resultados destas análises contribuem também para a garantia da conveniente consistência do produto final obtido.

Para além de uma conveniente caracterização do banco de células transformadas e dos testes de rotina a efectuar para controlo do processo produtivo, considerados na guideline sobre os substratos celulares, impõe-se aqui avaliar também as quantidades relativas de células que retêm a construção nucleotídica para expressão ou o número de cópias por célula quando se trate de elementos genéticos extra-cromossomais.

A construção para expressão bem como o clone celular que a contem deverão ser analisados para caracterização das sequências introduzidas e da proteína recombinante a obter na produção industrial. Todos os passos para a construção do vector deverão ser descritos detalhadamente, com inclusão da origem e funções pretendidas das sequências usadas (promotores, operadores, "enhancers", ORF, etc.). Deverá ser fornecido um mapa genético completo da construção, com indicação dos componentes e sua sequência nucleotídica, expressamente determinada ou retirada da bibliografia e suficientemente confirmada. Outras proteínas eventualmente expressas pela construção (resistência a antibióticos, por exemplo) deverão ser indicadas e convenientemente estudadas. A região codificante e as zonas de inserção desta deverão ser completamente sequenciadas na construção nucleotídica a utilizar na produção.

O limite do número de gerações das células produtoras, permitido durante a produção industrial, deverá ser determinado com base em investigação prévia que assegure a adequabilidade das culturas para o fim em vista, para além desse limite estabelecido.

A caracterização nucleotídica do vector de expressão, assim como a caracterização da proteína recombinante expressa deverão ser tão completas quanto possível e quanto for razoavelmente justificado. Pretende-se a garantia de uma adequada qualidade farmacêutica do produto final, particularmente no que se refere à identidade, homogeneidade e consistência de produção.

Segurança viral (3)

Alguns dos vectores utilizados para a expressão de proteínas recombinantes são agentes virais, que importa remover no processo de purificação do produto. Porque são produzidos por processos que passam por culturas de células, o fabrico dos medicamentos de biotecnologia é também susceptível de suportar o crescimento de agentes virais adventícios, adicionados ao sistema por contaminação dos reagentes utilizados. Apesar da extensiva caracterização das matérias primas iniciais (banco de células) e controlo das especificações, do produto final e de produtos intermediários, importa conhecer o processo de fabrico relativamente à sua capacidade para remover ou inactivar agentes virais. É necessária uma garantia suplementar de qualidade e segurança do produto final, no sentido de que na ocorrência de uma eventual infecção adventícia não detectada pelos controlos "in process", não fique comprometida a utilização clínica a que o medicamento se destina.

Como se referiu atrás, os bancos de células, durante o seu estabelecimento, deverão ser testados de forma a garantir a ausência de agentes virais indesejados. Estes testes deverão ser efectuados não só nas células dos bancos como em condições de produção industrial, para além do número de duplicações celulares especificado. É particularmente importante proceder à pesquisa de vírus relevantes em função da origem da célula utilizada e da utilização clínica do produto. Para além doutros vírus patogénicos para o Homem é também necessária a realização de testes exaustivos para a detecção de retrovírus. Deverão ser utilizados testes de infecciosidade em outras linhas celulares diferentes, observação directa em microscópio electrónico e avaliação da actividade enzimática de transcriptase reversa. Importa também realizar ensaios "in vivo" em murganhos adultos e recém-nascidos e em ovos embrionados, bem como testar a indução de anticorpos específicos anti-virais em animais injectados com o produto em estudo. A realização sequencial de todos estes testes dependerá dos resultados negativos que forem sendo obtidos nos testes anteriores. Na hipótese da detecção da presença de um vírus não esperado, há que estudar a sua origem, só sendo admissível considerar situações em que a origem da contaminação seja bem determinada e seja possível evitar contaminação idêntica no futuro.

A detecção de um vírus não esperado numa linha celular inviabilizará, em princípio, a sua utilização como hospedeira do vector a exprimir a proteína recombinante para a produção industrial do medicamento.

Dependente dos resultados de qualificação do substrato celular e dos resultados obtidos com as células depois da expansão para além do limite previsto para a produção, definir-se-ão os testes anti-virais a realizar no produto a granel ou no produto final.

Testes de validação viral

Adicionalmente à não detecção de contaminantes virais endógenos do substrato celular, o processo de produção industrial deverá incluir passos para remover ou inactivar vírus inadvertidamente adicionados ao sistema ou cuja presença não possa ser evitada (vectores de expressão, por exemplo). Estes passos deverão ser estudados de forma a determinar a sua efectiva capacidade para reduzir de forma significativa a infecciosidade associada à presença desses vírus: é a chamada validação viral.

Para proceder à validação de qualquer técnica será necessário proceder à sua instalação laboratorial em condições experimentais tão próximas quanto possível da técnica incluída no processo industrial. No laboratório a técnica deverá ser executada com o mesmo material depois de adicionado de quantidades conhecidas de vírus a estudar. As cargas virais remanescentes depois de executada a técnica laboratorial deverão se avaliadas e reconciliadas com a quantidade inicialmente introduzida no sistema. Se se tratar de um processo inactivador de vírus, será necessário estudar também a cinética dessa inactivação.

Os vírus a utilizar na validação viral destes processos, se não puderem ser os próprios, deverão possuir características físico-químicas semelhantes aos que forem relevantes para o processo industrial. Adicionalmente deverão também ser utilizados outros vírus com outras características físico-químicas que, no seu conjunto, possam representar o maior número possível de agentes virais diferentes. Pretende-se demonstrar a robustez do processo na eliminação ou inactivação de eventuais contaminações virais não previsíveis.

Os resultados obtidos deverão ser estatisticamente tratados para determinação dos coeficientes de remoção / inactivação, que se exprimem nos logaritmos das quantidades relativas de vírus não detectados.

A avaliação e aceitabilidade dos resultados dos testes de remoção / inactivação viral dependerá da adequabilidade do ensaio, dos vírus escolhidos, do esquema de purificação, do nível de redução conseguido, dos efeitos potenciais no processo de purificação e dos limites de detecção e sensibilidade dos testes executados.

 

Minimização do risco de transmissão de TSEs (4)

Na sequência da identificação no Reino Unido de uma nova doença transmissível em bovinos, causadora de encefalopatia espongiforme – a BSE, as autoridades de saúde Europeias assumiram, desde logo, o pressuposto da possibilidade da sua transmissão ao Homem e adoptaram uma guideline que prevê um conjunto de medidas destinadas a minimizar o risco dessa transmissão pela utilização de medicamentos. Foi desaconselhada a utilização de matérias primas de origem bovina na produção de medicamentos. Mais recentemente, ao ser reconhecida a possibilidade de transmissão do agente causador da BSE a ovinos e caprinos, os tecidos destes animais foram também incluídos no âmbito da guideline.

Quando não é possível deixar de utilizar produtos extraídos destes animais na produção de medicamentos, é recomendada a minimização do risco de transmissão do agente pela conveniente consideração cumulativa dos seguintes três factores principais:

1.- A origem geográfica dos animais. Só é aceitável a utilização de matérias primas preparadas destes animais quando originários de países em que a doença não tenha grande incidência e em que exista instalado um sistema de vigilância veterinária adequado.

2.- O tipo de tecido. Tendo em conta a infecciosidade dos diferentes tecidos em animais afectados pela doença, foi estabelecida uma classificação com quatro categorias correspondentes a diferentes níveis de infecciosidade. O tipo de tecido e a eventual contaminação não evitável com outros tecidos de maior risco relativo são factores a ter em conta na avaliação do medicamento.

3.- O processo de produção. Em complemento da origem dos animais e do tipo de tecido, deverá também ser considerado o processo de fabrico e a sua capacidade para reduzir uma eventual infecciosidade remanescente na matéria prima inicial.

A aceitabilidade de qualquer medicamento preparado com matérias primas de animais susceptíveis à transmissão não deliberada do agente causador da BSE depende, da avaliação do binómio benefício / risco. Aqui se considera a origem dos animais, o tipo de tecido, o processo de fabrico, a dose, a duração do tratamento e a via de administração a par da utilização clínica do medicamento e da sua relevância terapêutica.

 

(1) - Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Derivation and characterisation of cell substrates used for production of biotechnological / biological products (ICH, step 4). CPMP/ICH/294/95.

(2) -Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Analysis of the expression construct in cell lines used for production of r-DNA derived protein products (ICH, step 4). CPMP/ICH/139/95.

(3) - Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Viral safety evaluation of biotechnological products derived from cell lines of human and animal origin (ICH, step 4). CPMP/ICH/295/95.

(4) - Note for Guidance on Minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via medicinal products (revised). CPMP/BWP/877/96.

 

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